細(xì)胞周期的調(diào)控（cellcyclins）

1、CELL CYCLE,第二節(jié)細(xì)胞周期的調(diào)控,一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用,1970s Rao和Johnson發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞(Hela)融合的間期細(xì)胞染色體發(fā)生凝縮，稱為早熟凝集染色體(prematurely condensed chromosome，PCC)。G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個(gè)部位開始復(fù)制。G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。甚至不同類的M期細(xì)胞也可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，

2、說明M期細(xì)胞具有促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor， MPF)。,染色體超前凝集（PCC）,細(xì)胞融合與PCC(Premature chromosomal condense),人們猜測(cè)，在M期的細(xì)胞中存在著某種物質(zhì)，它能夠促進(jìn)染色體的凝聚和細(xì)胞的分裂。后來，人們?cè)诓煌愋偷腗期細(xì)胞中分別提取出了能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂的的因子，統(tǒng)稱為成熟促進(jìn)因子(maturation promoti

3、ng factor，MPF)。,處于第六期的爪蟾卵母細(xì)胞（RD前期I），具GV。,爪蟾卵子成熟過程,MPF的發(fā)現(xiàn)？,注射實(shí)驗(yàn)表明：孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟；成熟卵細(xì)胞質(zhì)中，含有卵母細(xì)胞成熟的因子，稱做MPF。,◆MPF是一種使多種底物蛋白磷酸化的蛋白激酶； 主要含有p32和p45兩種蛋白,二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系 1960s Leland Hartwell 芽殖酵母 1970s Pa

4、ul Nurse 裂殖酵母 利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(cell division cycle gene, CDC)。如,—裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無法分裂—wee1突變型則提早分裂，cdc25突變型細(xì)胞體積增大而不分裂—cdc2和cdc28都編碼一個(gè)34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行 其產(chǎn)物分別為p34cdc2 （G2/M）、 p34cd

5、c28（G2/S或G2/M） weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進(jìn)CDC2的活性。,Fission yeast （裂殖酵母）,budding yeast （芽殖酵母）,Cdc 25 & Wee1 mutant,1980s Timothy Hunt發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期振蕩，命名為周期蛋白(cyclin A和B)。后來發(fā)現(xiàn)各類動(dòng)物來源的細(xì)胞周期蛋白mRNA均能誘導(dǎo)蛙卵的成熟。1988年Lohka

6、將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由32KD和45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=Cdc2+clyclin B,1988年M. J. Lohka 純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。,MPF、Cdc和Cyclin的關(guān)系,MPF的生化成分：含有兩個(gè)亞單位MPF =Cdc2+cyclin （催化亞單位+調(diào)節(jié)亞單位）,后來Paul Nurse（19

7、90）進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明P32實(shí)際上是Cdc2的同源物，而P45是cyclinB的同源物，從而將細(xì)胞周期三個(gè)領(lǐng)域的研究聯(lián)系在一起。即MPF是由cyclin和CDC基因編碼的依賴于cyclin的蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)，,Leland H. Hartwell,R. Timothy (Tim) Hunt,Sir Paul M. Nurse,2001年10月8日美國(guó)人Leland Hartw

8、ell、英國(guó)人Paul Nurse、Timothy Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。,三、細(xì)胞周期蛋白cyclin,特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框（cyclin box），介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。（M期周期蛋白N端：破壞框；G1期周期蛋白：C端含PEST序列）作用：激活CDK，引導(dǎo)CDK作用于不同底物。已知30余種，在脊椎動(dòng)物中為A1-2、B1-

9、3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。,Destruction Box in Cyclins,不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體,*包括D1-3，各亞型cyclin D在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。,◆活化 ·隨Cyclin濃度變化而變化 ·激酶與磷酸酶的調(diào)節(jié)， 活化的MPF可使更多的MPF活化 ◆功能：?jiǎn)?dòng)細(xì)胞從G2期進(jìn)

10、入M期的相關(guān)事件,周期蛋白,,,,CDK1的調(diào)節(jié)與活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase,,,,,,Cdc2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。Cdc2又被稱為CDK1，可將特定蛋白磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行，又稱作細(xì)胞周期引擎。如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。在動(dòng)物中已知7

11、種CDK。均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。,四、CDK激酶和CDK激酶抑制劑,控制細(xì)胞周期的蛋白質(zhì),CDK類蛋白激酶：這類蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于細(xì)胞周期，包括DNA合成的啟動(dòng)和終止，染色體的凝集、運(yùn)動(dòng)和松懈，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纖層的降解和重新聚合，紡綞體的形成和消失等。它們可根據(jù)作用的時(shí)期不同分為G1、G1/S、S期CDK，及M期CDK。cyclin：

12、是一類能與CDK結(jié)合，使CDK磷酸化和活化的蛋白。這類蛋白的活性是隨細(xì)胞周期而進(jìn)行周期性的變化。,CDK抑制因子（CDK inhibitor，CKI） 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，目前發(fā)現(xiàn)的CKI分為兩大家族：①Ink4(Inhibitor of cdk 4)，如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特異性抑制cdk4·cyclin D1、cdk6&#

13、183;cyclin D1復(fù)合物。②Kip(Kinase inhibition protein)：包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性，P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）結(jié)合，直接抑制

14、DNA的合成,五、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控制,一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用二）M期周期蛋白與分裂中期向分裂后期轉(zhuǎn)化三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDK激酶,CDK激酶對(duì)cell cycle起核心性的調(diào)控作用，不同的cyclin結(jié)合不同的CDK，構(gòu)成不同的CDK激酶不同的CDK激酶在cell cycle不同時(shí)期表現(xiàn)出活性，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行不同的調(diào)節(jié)。,G1期，在生長(zhǎng)因子的刺激下，cyclin D表達(dá)，并與C

15、DK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。,1、G1期時(shí)MFP的激活,2、在G1-S期 cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。向細(xì)胞內(nèi)注射Cyclin E的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期，說明細(xì)胞進(jìn)入S期需要CyclinE的參與。同樣將CyclinA的抗體注射到細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能抑制細(xì)胞的DNA合成，推測(cè)Cyc

16、linA是DNA復(fù)制所必需的,3、在G2-M期 cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件,cell cycle regulation,,在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，通過一種未知的途徑，激活后期蛋白復(fù)合體-APC，將遍在蛋白連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個(gè)細(xì)胞周

17、期,分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱破壞框(destruction box)。泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識(shí)別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。26S蛋白酶體是一個(gè)大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。,Destruction Box in Cyclins,Anaphase Promoting Complex (APC), 調(diào)控紡錘體裝配檢驗(yàn)點(diǎn),

18、·APC介導(dǎo)選擇性降解的靶蛋白與Ubiquitin結(jié)合 (通過泛素依賴性途徑降解) ·APC主要介導(dǎo)兩類蛋白降解: Anaphase Inhibitors和Mitotic Cyclin. 前者維持姐妹染色單體粘連, 抑制后期啟動(dòng)；后者的降解意味著有絲分裂即將結(jié)束，即染色體開始去凝集，核膜重建。· Cdc20 和Mad2蛋白位于動(dòng)粒上，在染色體結(jié)合有絲分裂紡錘體前將不能從動(dòng)粒上釋放，由于Mad2與C

19、dc20結(jié)合而抑制APC的活性。所以只有所有染色體都與紡錘體結(jié)合后，APC才有活性，才啟動(dòng)細(xì)胞向后期轉(zhuǎn)換。,,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。結(jié)合cyclin B的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK activati

20、ng kinase CAK)的作用下完成的。,M期CDK的激活,CDK activating,,DNA的復(fù)制是由起始復(fù)制點(diǎn)（origins of replication）開始的，起始復(fù)制點(diǎn)是一種自主復(fù)制序列，散布在染色體上。在整個(gè)細(xì)胞周期中，起始復(fù)制點(diǎn)上結(jié)合有復(fù)制起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體（Origin recognition complex, Orc），其作用就象一個(gè)停泊點(diǎn)，供其它調(diào)節(jié)因子?？?。Cdc6是其中的一個(gè)調(diào)節(jié)因子，在G1期CDC6含

21、量瞬間提高，Cdc6結(jié)合在Orc上，在ATP供能下，促進(jìn)6個(gè)亞單位構(gòu)成的MCM復(fù)合體和其他一些蛋白結(jié)合到ORC上，形成前復(fù)制復(fù)合體（pre-replicative complex，pre-RC）DNA復(fù)制執(zhí)照因子學(xué)說；MCM實(shí)際上就是DNA解旋酶。,DNA復(fù)制的控制,S-CDK觸發(fā)pre-RC的啟動(dòng)，同時(shí)阻止了DNA再次進(jìn)行復(fù)制，因?yàn)镾-CDK將CDC6磷酸化，使其脫離ORC，磷酸化的CDC6隨后被SCF參與的遍在蛋白化途徑降解。從而

22、保證了DNA的復(fù)制當(dāng)且僅當(dāng)一次,限制點(diǎn)在細(xì)胞周期中的作用,細(xì)胞要分裂，必須正確復(fù)制DNA和達(dá)到一定的體積，在獲得足夠物質(zhì)支持分裂以前，細(xì)胞不可能進(jìn)行分裂。細(xì)胞周期的運(yùn)行，是在一系列稱為檢驗(yàn)點(diǎn)（check point）的嚴(yán)格檢控下進(jìn)行的，當(dāng)DNA發(fā)生損傷，復(fù)制不完全或紡錘體形成不正常，周期將被阻斷。,細(xì)胞周期的限制點(diǎn)有四個(gè)： G1/S檢驗(yàn)點(diǎn):在酵母中稱start點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中稱R點(diǎn)(restriction point)，控制細(xì)胞由靜

23、止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？ S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？ G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？ 中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）：任何一個(gè)著絲點(diǎn)沒有正確連接到紡錘體上，都會(huì)抑制APC的活性，引起細(xì)胞周期中斷。,Four checkpoints,,ATM（ataxia telangiect

24、asia-mutated gene）。最早發(fā)現(xiàn)于毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥患者，人類中大約有1%的人是ATM缺失的雜合子，表現(xiàn)出對(duì)電離輻射敏感和易患癌癥。ATM編碼一個(gè)蛋白激酶，結(jié)合在損傷的DNA上，其信號(hào)通路有兩條。①激活Chk1（checkpoint kinase）, 使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中斷細(xì)胞周期。②激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作為轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致P21的表達(dá)，

25、P21抑制G1-S期CDK的活性，中斷細(xì)胞周期。,,癌基因和抑癌基因——主要的內(nèi)在因素’外在因素：離子輻射、化學(xué)物質(zhì)作用、病毒感染、溫度變化、PH變化等,六、其他內(nèi)在和外在因素在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用,七、生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞增殖的影響,單細(xì)胞生物的增殖取決于營(yíng)養(yǎng)，多細(xì)胞生物細(xì)胞的增殖與信號(hào)途徑有關(guān)。生長(zhǎng)因子：是與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號(hào)物質(zhì)，已知幾十種，多數(shù)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，又稱有絲分裂原（mitogen），如EGF、NGF。作用方式：旁分泌