長鏈非編碼RNA HOTAIR通過上調(diào)GLUT1表達促進肝癌細胞糖酵解實驗研究.pdf

1、目的：肝癌在我國屬于高發(fā)的且危害極大的實體惡性腫瘤之一，其發(fā)病過程及其復(fù)雜。然而，目前對于肝癌的治療卻不能達到令人滿意的效果，無論采用何種治療方式，其預(yù)后往往較差，對于提高總體生存率的作用很有限。目前，人們將焦點集中于肝癌其發(fā)病機制的研究。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(long non-codingRNA，lncRNA)在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制中起到了重要的作用。在肝癌中，HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcr

2、ipt antisense RNA，lncRNA-HOTAIR)是一個促癌基因。目前的研究表明，LncRNA-HOTAIR與肝癌細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后息息相關(guān)。此外，在肝癌等實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，常常伴隨有細胞能量代謝方式的改變，不同于正常細胞依賴于氧化磷酸化為其提供必要的能量需求，肝癌細胞并不依靠這種供能效率更高的方式產(chǎn)生能量而是主要依賴于糖酵解。即使在氧氣充足的情況下，肝癌等實體腫瘤依然不通過氧化磷酸化為其功能，而是通過

3、有氧糖酵解為其提供必要的能量來源，這種有氧糖酵解的現(xiàn)象稱之為沃伯格效應(yīng)（Warburg effect）。Warburg效應(yīng)的意義不僅在于其能為腫瘤細胞生長提供必要的能量，還在于通過這種方式，可以為腫瘤細胞提供生長所必需的物質(zhì)基礎(chǔ)，最終影響腫瘤細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥性等多個方面。那么lncRNA-HOTAIR既然能夠促進肝癌細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，是否也可以通過促進其能量代謝方式的改變，從而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展呢？如果能夠產(chǎn)生影

4、響，那又是通過什么機制而實現(xiàn)的呢？本課題擬通過western blot，PCR，RIP等實驗技術(shù)探索lncRNA-HOTAIR是否能夠調(diào)節(jié)肝癌細胞能量代謝，以及其具體機制，從而為肝癌的臨床診治提供新的方向、思路與理論基礎(chǔ)。
　　方法：⑴選取84例肝癌患者肝癌組織及癌旁組織，應(yīng)用real-time PCR檢測肝癌組織lncRNA-HOTAIR的表達及其表達與臨床病病理參數(shù)的關(guān)系；⑵應(yīng)用real-time PCR檢測肝癌細胞系HepG

5、2，SMMC-7721，Hep3B，Huh7，Bel-7402中l(wèi)ncRNA-HOTAIR的表達情況；⑶應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建高/低表達lncRNA-HOTAIR的肝癌細胞系，并應(yīng)用CCK8試劑盒檢測高/低lncRNA-HOTAIR肝癌細胞系增殖能力的變化；⑷應(yīng)用葡萄糖檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒檢測高/低lncRNA-HOTAIR肝癌細胞系中糖酵解的情況；⑸應(yīng)用real time-PCR，western blot檢測高表達lncRNA

6、-HOTAIR肝癌細胞系中糖酵解關(guān)鍵酶及關(guān)鍵分子的表達情況;高/低表達lncRNAOHOTAIR肝癌細胞系中應(yīng)用western blot檢測GLUT1表達情況;應(yīng)用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOTAIR與si-GLUT1，檢測GLUT1表達、肝癌細胞糖酵解情況；⑹高/低表達lncRNA-HOTAIR肝癌細胞系中western blot檢測p-mTOR表達情況;高表達lncRNA-HOTAIR肝癌細胞系中應(yīng)用雷帕霉素阻斷mTOR信號的

7、活性，應(yīng)用western blot檢測GLUT1的表達，應(yīng)用葡萄糖試劑盒及乳酸試劑盒檢測糖酵解情況;應(yīng)用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實驗(RNA Binding ProteinImmunoprecipitation，RIP)驗證lncRNA-HOTAIR與GLUT1的結(jié)合。
　　結(jié)果：①通過提取84例HCC患者腫瘤組織及癌旁組織的總RNA，應(yīng)用real-time PCR檢測lncRNA-HOTAIR在其中的表達情況，結(jié)果表明在總體上，l

8、ncRNA-HOTAIR在肝癌組織中表達明顯高于癌旁組織;此外，我們分析了lncRNA-HOTAIR的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果表明，lncRNA-HOTAIR與肝癌的腫瘤大小相關(guān)。②檢測了幾種不同的肝癌細胞系肝癌細胞系中，lncRNA-HOTAIR的表達情況，結(jié)果顯示，與對照組相比而言，在這幾種肝癌細胞系中，lncRNA-HOTAIR的表達量均較為明顯的增高，在HepG2肝癌細胞系中，lncRNA-HOTAIR相對表達量最高，

9、而在Hep3B肝癌細胞系中，lncRNA-HOTAIR相對表達量最低。③為了評測lncRNA-HOTAIR對HCC細胞的增殖能力的影響，我們進行CCK8增殖實驗以檢測lncRNA-HOTAIR對HCC細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，在過表達lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細胞系中，細胞的增殖能力明顯提高;而與之相反的是，在降低了lncRNA-HOTAIR的HepG2肝癌細胞系中，細胞的增殖能力明顯降低。這說明，lncRNA-HO

10、TAIR能夠提高HCC細胞的增殖能力。④分別檢測過表達lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細胞系以及降低了lncRNA-HOTAIR表達的HepG2肝癌細胞系中葡萄糖消耗與乳酸生成的情況，結(jié)果顯示過表達lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細胞系組，與對照組相比，血清中葡萄糖的消耗與乳酸的生成明顯的增加;而與此相反的是，降低lncRNA-HOTAIR表達的HepG2肝癌細胞系組，與對照組相比，血清中葡萄糖的消耗與乳酸的生成明顯

11、的減少，這說明lncRNA-HOTAIR能夠促進HCC細胞的糖酵解的發(fā)生。⑤在過表達lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細胞系中檢測幾種關(guān)鍵酶mRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA-HOTAIR促進GLUT1的表達最為明顯;進一步實驗表明lncRNA-HOTAIR可以促進GLUT1的表達;以上結(jié)果表明，lncRNA-HOTAIR是通過調(diào)節(jié)GLUT1的方式從而調(diào)節(jié)HCC細胞的糖酵解的。⑥為探討lncRNA-HOTAIR調(diào)節(jié)GLU

12、T1的機制，我們檢測過表達lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細胞系及降低lncRNA-HOTAIR表達的HepG2肝癌細胞系中磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，降低lncRNA-HOTAIR表達導(dǎo)致p-mTOR蛋白表達降低;而與之相反的是，過表達lncRNA-HOTAIR導(dǎo)致p-mTOR蛋白表達升高。這說明，lncRNA-HOTAIR能夠激活mTOR信號。此外，為了驗證mTOR對糖酵解及其關(guān)鍵酶GLUT1的

13、調(diào)節(jié)，我們應(yīng)用mTOR抑制劑----雷帕霉素抑制mTOR的表達，然后檢測GLUT1的表達，結(jié)果顯示，隨著mTOR被抑制，GLUT1的表達也隨之降低;此外，隨著mTOR被抑制，葡萄糖消耗及乳酸生成也隨之減少，這說明在HCC細胞中p-mTOR確實可以促進其糖酵解，另一方面，為了探究lncRNA-HOTAIR是否也可以通過直接與GLUT1相結(jié)合從而促進GLUT1的表達，我們進行了RIP實驗，結(jié)果顯示，lncRNA-HOTAIR與GLUT1確實

14、可以相結(jié)合，這說明，lncRNA-HOTAIR也可以通過直接靶向GLUT1從而調(diào)節(jié)HCC細胞的糖酵解。以上結(jié)果表明，lncRNA-HOTAIR可以通過調(diào)節(jié)mTOR的活性及與GLUT1直接結(jié)合兩種方式促進GLUT1表達，從而促進HCC細胞的糖酵解。
　　結(jié)論：⑴肝癌組織中，lncRNA-HOTAIR呈高表達并與肝癌的腫瘤大小相關(guān)；⑵肝癌細胞系中l(wèi)ncRNA-HOTAIR呈高表達；⑶lncRNA-HOTAIR可以促進肝癌細胞增殖；⑷L