HPV16介導HIF-1α上調(diào)肺癌細胞Glut1表達的分子機制.pdf

1、前言：
　　HPV16 E6/E7調(diào)控Glut1表達的具體機制不清。我們發(fā)現(xiàn)肺癌及癌前期病變細胞中HPV16 E6/E7、HIF-1α及Glut1表達增高，并且HPV16 E6/E7與HIF-1α和Glut1呈正相關(guān)。已有報道HPV16E6或E7可上調(diào)HIF-1α的活性，另有報道HIF-1α可上調(diào)Glut1的mRNA和蛋白表達，但HPV-16 E6/E7是否可介導HIF-1α上調(diào)Glut1的表達，促進轉(zhuǎn)運更多的葡萄糖來滿足癌細胞的

2、高代謝率和增長速度現(xiàn)在還不清楚。為此我們擬用p-EGFP-N1-HPV16 E6/E6mut、p-EGFP-N1-HPV16 E7/E7mut及p-EGFP-N1質(zhì)粒以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞株，檢測E6、E7、HIF-1α、Glut1的蛋白和mRNA表達;siRNA沉默HPV16E6后，檢查HIF-1α及Glut1的表達變化，明確HPV-16上調(diào)Glut1表達的具體機制。
　　材料與方法：
　　一、材料
　　（一）臨床資料<

3、br>　　收集2011年1月至2012年7月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診及病房胸水標本150例，其中肺腺癌92例，肺鱗癌3例，炎癥35例，結(jié)核20例。
　?。ǘ┘毎?br>　　肺癌細胞系A(chǔ)549（人肺腺癌系）、H1299（人肺腺癌系）、NCI-H460（人大細胞肺癌系）均購自上海中科院細胞生物所，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液進行傳代。LK2（人肺鱗癌細胞系）購自上海中科院細胞生物所，用含10％小牛血清的DMEM

4、培養(yǎng)液進行傳代。血清、RPMI-1640培養(yǎng)液及DMEM培養(yǎng)液購自Hyclone公司。
　?。ㄈ嶒炗闷?br>　　1、主要試劑
　　HPV16E7兔抗人多克隆抗體、Glut1山羊抗人多克隆抗體、HIF-1a兔抗人多克隆抗體及HPV16E6兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物公司，DAB酶底物顯色試劑盒和S-P超敏試劑盒均購自福州買新生物技術(shù)開發(fā)公司，Real-timePCR引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司，Prime

5、Script RT reagent Kit(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司，Lipo2000購自上海英濰捷基，p-EGFP-N1-HPV16 E6/E6mut、p-EGFP-N1-HPV16 E7/E7mut及p-EGFP-N1質(zhì)粒均由廣東醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究所唐旭東教授惠贈。
　　2、試驗儀器
　　攤、烤片機(LS-90) 沈陽龍首電子儀器公司

6、；
　　冰箱 青島海爾股份有限公司；
　　恒溫箱 沈陽醫(yī)療器械廠；
　　電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；
　　免疫組化保濕盒 福州邁新生物技術(shù)有限公司；
　　醫(yī)學圖像采集分析系統(tǒng) 日本Olympus公司；
　　低溫超速離心機和低速離心機Hitachi，日本；
　　紫外分光光度計和凝膠成像系統(tǒng)UVP，英國；
　　CO2培養(yǎng)箱Heraeus，德國；
　　超凈臺 蘇州凈化設(shè)備

7、；
　　ABI 7900HT儀器Applied Biosystems,USA；
　　NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Wilmington,USA)；
　　基因擴增儀G-Storm，英國；
　　電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療；
　　超聲細胞粉碎機 寧波新芝；
　　電泳及轉(zhuǎn)印儀Bio-Rad，美國；
　　酶標儀Bio-Rad，美國。
　　二、方法

8、>　　1、免疫細胞化學技術(shù)
　　采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)法行抗HPV16E6(1∶200)，HPV16E7(1∶200)，Glut1(1∶100)免疫細胞化學染色。細胞塊切片，常規(guī)脫蠟至水，高溫進行抗原修復，一抗4℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復染。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性肺癌切片做陽性對照。
　　2、細胞瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率測定
　　轉(zhuǎn)染前一天將細胞按60％-70％密度接種于6孔板，

9、采用Lipofectamine TM 2000(英濰捷基，上海)轉(zhuǎn)染試劑按照說明書進行轉(zhuǎn)染，24h測轉(zhuǎn)染效率，并終止細胞培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。流式檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　3、Real-time PCR實驗
　　利用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)合成特異性的cDNA，總反應(yīng)體系10μl（總RNA5μl），在基因擴增儀（G-Storm，英國）內(nèi)經(jīng)過如下循環(huán)完成反轉(zhuǎn)錄實驗過程

10、:37℃，15min;85℃，5see，4℃貯存，次日擴增待用。Real-time PCR在Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems，USA)內(nèi)完成。反應(yīng)體系20μl，包括cDNA0.25μl，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ優(yōu)化程序進行擴增，采用相對定量的方法，循環(huán)過程如下:95℃，30sec;95℃，15sec;60℃

11、，30sec;40個循環(huán)。實驗組及對照組均設(shè)2次重復。用3次獨立樣本經(jīng)過3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)用公式RQ=2-△△△Ct的方法進行分析。
　　4、Western blot
　　收集培養(yǎng)的細胞，加入蛋白裂解液充分裂解，4℃靜置，孵育40min，4℃離心20min(12000g/min)，取上清，放入-70℃冰箱保存。用Brodford法測蛋白濃度，每孔50ug蛋白上樣量，12％SDS-PAGE凝膠電泳，4℃，40V條件過夜，

12、濕電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)入0.22umPVDF膜，5％脫脂奶粉封閉2h，一抗HPV16E6(1∶100),HPV16E7(1∶100),HIF-1a(1∶200),Glut1(1∶200),GAPDH(1∶1000),β-action(1∶1200)4℃過夜，37℃二抗孵育2h，化學發(fā)光，顯影，以β-actin、GAPDH為內(nèi)參，用凝膠成像分析系統(tǒng)（BioImaging Systems，美國）分析蛋白條帶灰度值，每組結(jié)果均為相同條件重復3次。

13、
　　三、統(tǒng)計學分析
　　應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理:采用mean±SD分析各組數(shù)據(jù)的平均值和標準差。采用One way ANOVA，Dunnett T3進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.HPV16、HIF-1α和Glut1在部分肺癌患者胸水中的表達水平明顯增高
　　2.轉(zhuǎn)染效率的檢測介于39.85％至47.09％。
　　3.在非小細胞肺癌細胞中HPV-

14、16 E6和E7癌蛋白增強HIF-1α蛋白及mRNA的表達
　　4.在非小細胞肺癌細胞中HPV-16 E6和E7癌蛋白增強Glut1蛋白及mRNA的表達
　　5.LK2、A549細胞系進行HPV16 E6-siRNA干擾后HPV16E6、HIF-1α及Glut1蛋白水平及mRNA水平表達降低
　　6.LK2、A549細胞系進行HIF-1α-siRNA干擾后HIF-1α及Glut1蛋白水平及mRNA水平表達降低