缺氧條件下HIF-1α上調(diào)ABCG2表達(dá)并參與ABCG2介導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞系耐藥.pdf

1、目的：
　　肺癌是當(dāng)前發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤。MDR是導(dǎo)致肺癌患者化療失敗預(yù)后不佳的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下HIF-1α和多種耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)增高，可能介導(dǎo)了腫瘤MDR的發(fā)生。本課題旨在研究HIF-1α和ABCG2在肺癌中的表達(dá)和作用，為肺癌治療提供新的思路。
　　方法：
　　1．收集非小細(xì)胞肺癌病例60例，分別取癌組織、癌旁組織和正常肺組織，用免疫組化法檢測(cè)HIF-1α和ABCG2在癌組織和正常組織中的表

2、達(dá)。分析HIF-1α表達(dá)與患者病理類型、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；分析HIF-1α和ABCG2表達(dá)相關(guān)性。
　　2．利用siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，MTT法檢測(cè)下調(diào)HIF-1α后A549細(xì)胞對(duì)藥物耐受性變化。
　　3．Westernblot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A549-siRNA-ABCG2和正常A549細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)；Westernblot法檢測(cè)缺氧24小時(shí)后，A549細(xì)胞中HIF-1α和A

3、BCG2的蛋白表達(dá)水平；Westernblot法檢測(cè)了常氧和缺氧條件下A549細(xì)胞、不同缺氧時(shí)間段A549-siRNA-HIF-1α細(xì)胞中HIF-1α和ABCG2的表達(dá)情況；用siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞下調(diào)ABCG2的表達(dá)，MTT法觀察siRNA-ABCG2的A549細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性變化；MTT法比較常氧條件下A549細(xì)胞和缺氧下沉默ABCG2和未沉默ABCG2的A549細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果：
　　1．免疫組化染色結(jié)果顯

4、示：HIF-1α免疫組化染色主要定位于胞核和胞漿，呈棕黃色或棕褐色染色，HIF-1α在癌組織中表達(dá)率為60％（36/60），在癌旁和正常組織中無表達(dá)；HIF-1α在鱗癌中的表達(dá)率為50.00％（14/28），在腺癌中的表達(dá)率為68.75％(22/32)，兩組之間無明顯差異（P>0.05）；HIF-1α在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期中的表達(dá)率分別為25％（4/16），58.82％（10/17），81.48％(22/27)，患者TNM分期越晚，HIF-

5、1α表達(dá)率越高，具有顯著差異（p<0.05）；在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者標(biāo)本中表達(dá)率為25％（5/20），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中表達(dá)率為77.50％（31/40），淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者HIF-1α的表達(dá)率增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩組間有顯著差異（P<0.05）。ABCG2在60例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中表達(dá)率為63.33％（38/60），HIF-1α和ABCG2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)性，具有顯著性差異(rs=0.581,P<0.05)。結(jié)果表明：HI

6、F-1α表達(dá)與病理類型無關(guān)，患者TNM分期越晚表達(dá)越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)更高。HIF-1α和ABCG2表達(dá)存在共定位，二者表達(dá)存在明顯正相關(guān)。
　　2．建立了A549-siRNA-HIF-1α，經(jīng)westernblot法檢測(cè)其HIF-1α蛋白表達(dá)明顯低于缺氧A549中的表達(dá)；MTT法檢測(cè)常氧和缺氧下A549對(duì)順鉑耐藥性，缺氧下細(xì)胞存活率高于常氧下；MTT法檢測(cè)缺氧下A549-siRNA-HIF-1α和A549細(xì)胞的敏感性，A54

7、9-siRNA-HIF-1α細(xì)胞存活率要明顯低于A549細(xì)胞存活率。說明缺氧條件下，HIF-1α可使A549細(xì)胞耐藥性增加，下調(diào)HIF-1α表達(dá)可增加對(duì)藥物的敏感性。
　　3．用siRNA-ABCG2轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞下調(diào)ABCG2，經(jīng)westernblot法檢測(cè)A549-siRNA-ABCG2中ABCG2表達(dá)明顯降低；缺氧下，HIF-1α和ABCG2表達(dá)均較常氧下增高；westernblot法分別檢測(cè)了常氧和缺氧條件下A549細(xì)胞

8、、不同缺氧時(shí)間段A549-siRNA-HIF-1α細(xì)胞中HIF-1α和ABCG2的表達(dá)，結(jié)果缺氧條件下，在HIF-1α沉默的A549細(xì)胞中：HIF-1α表達(dá)降低，且隨缺氧時(shí)間延長而減低；ABCG2表達(dá)同時(shí)降低，同為時(shí)間依賴型。用MTT法觀察siRNA-ABCG2的A549細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性變化，發(fā)現(xiàn)缺氧下siRNA-ABCG2后的A549細(xì)胞存活率要高于對(duì)照細(xì)胞；用MTT法比較常氧條件下A549細(xì)胞和缺氧下沉默ABCG2和未沉默ABCG

9、2的A549細(xì)胞存活率，結(jié)果未沉默ABCG2的存活率最高，沉默ABCG2的次之，常氧細(xì)胞存活率最低。結(jié)果表明：缺氧條件下HIF-1α可上調(diào)ABCG2蛋白水平的表達(dá)，HIF-1α通過上調(diào)ABCG2的表達(dá)參與ABCG2介導(dǎo)的A549細(xì)胞耐藥性。
　　結(jié)論：
　　1．HIF-1α和ABCG2在NSCLC中高表達(dá)，HIF-1α表達(dá)與患者TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；HIF-1α和ABCG2在NSCLC中共定位表達(dá)，存在著明顯正相關(guān)