耐藥基因ABCG2在食管癌中的表達(dá)及青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)耐藥的作用研究.pdf

1、目的：食管癌（esophagealcarcinoma，EC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一?；熓悄壳笆彻馨┚C合治療的主要方法之一，但是在化療過(guò)程中出現(xiàn)的多藥耐藥是導(dǎo)致臨床化療失敗的重要原因。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)ABCB1及ABCG2基因、蛋白在食管癌組織、非典型增生及食管正常粘膜中的表達(dá)，觀察其是否參與食管癌發(fā)生及耐藥的形成。
　　 青蒿琥酯（artesunate，Art）是我國(guó)常用的抗瘧藥物，青蒿琥酯對(duì)

2、多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，本課題小組以前的研究結(jié)果也提示青蒿琥酯對(duì)食管癌細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯抗腫瘤具有不產(chǎn)生交叉耐藥的特點(diǎn)，提示青蒿琥酯可能具有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用。
　　 為此，本實(shí)驗(yàn)利用了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究ABCB1及ABCG2表達(dá)與食管癌多藥耐藥的關(guān)系及青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)食管癌耐藥作用及機(jī)制，為臨床上食管癌的化療提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.ABCB1及ABCG2在食管癌中的表

3、達(dá)及其生物學(xué)意義。
　　 2.阿霉素誘導(dǎo)食管癌耐藥細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)及其意義。
　　 RT-PCR、Western-blot、FCM方法檢測(cè)Eca109、Eca109/ADM細(xì)胞中ABCG2基因及蛋白的表達(dá)情況，F(xiàn)CM檢測(cè)ABCB1蛋白表達(dá)。激光共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)檢測(cè)Eca109/ADM細(xì)胞中ABCG2蛋白定位及表達(dá)。ADM藥物干預(yù)Eca109、Eca109/ADM細(xì)胞生長(zhǎng)，利用FCM檢測(cè)Eca109、Eca109

4、/ADM細(xì)胞中ADM含量，從而反映細(xì)胞對(duì)藥物外排作用。Art、ADM藥物干預(yù)Eca109/ADM細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞中ABCB1、ABCG2表達(dá)。
　　 3.食管癌耐藥細(xì)胞系Eca109/ABCG2的建立及其生物學(xué)特征的研究。
　　 4.青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)Eca109/ABCG2細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥作用及機(jī)制。
　　 5青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)裸鼠種植食管癌耐藥作用研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.ABCB1及

5、ABCG2在食管癌中的表達(dá)及其生物學(xué)意義RT-PCR及FCM結(jié)果顯示，ABCB1和ABCG2mRNA及蛋白在食管癌組織中表達(dá)均顯著高于食管正常粘膜（P<0.01），在食管正常粘膜、非典型增生、癌組織之間呈現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì)（P<0.05）。食管癌組織中，ABCB1及ABCG2mRNA和蛋白與分化程度、浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05），與性別和年齡無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05）。食管癌組織中ABCG2mRNA及蛋白表達(dá)與ABCB1

6、mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性（rs=0.077，P=0.499；rs=-0.087，P=0.444）。
　　 IHC結(jié)果顯示：ABCB1和ABCG2陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜和胞漿，呈棕黃色顆粒狀，彌漫或散在分布。食管鱗癌組織中.ABCB1和ABCG2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（77.50％和86.25％）明顯高于不典型增生組織（31.25％和26.25％）和正常粘膜（6.25％和3.75％）（P<0.01）。
　　 2.阿霉素誘導(dǎo)食管

7、癌耐藥細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)及其意義歷時(shí)8個(gè)月，成功培養(yǎng)了耐藥細(xì)胞株Eca109/ADM，與Eca109細(xì)胞相比，Eca109/ADM細(xì)胞體積變大，形態(tài)更不規(guī)則。MTT方法檢測(cè)，阿霉素（ADM）藥物作用Eca109/ADM和Eca109細(xì)胞24h，IC50值分別為15.45±1.15，4.69±0.88，Eca109/ADM細(xì)胞耐藥系數(shù)為3.29。
　　 RT-PCR、FCM、Western-blot方法檢測(cè)到Eca109/AD

8、M細(xì)胞中ABCG2mRNA和蛋白的表達(dá)量較Eca109細(xì)胞顯著增高（O<0.05）。激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)顯示，Eca109/ADM細(xì)胞中ABCG2蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞膜及胞漿，與Eca109細(xì)胞相比，ABCG2蛋白表達(dá)增高。FCM檢測(cè)ABCB1蛋白在Eca109/ADM細(xì)胞表達(dá)量顯著高于Eca109細(xì)胞（P<0.05）。
　　 藥物外排試驗(yàn)，F(xiàn)CM檢測(cè)Eca109/ADM細(xì)胞外排阿霉素的作用強(qiáng)于Eca109細(xì)胞。Art與ADM

9、聯(lián)合用藥于Eca109/ADM細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率顯著高于ADM、Art單獨(dú)應(yīng)用（P<0.05）。Art作用Eca109/ADM細(xì)胞48h，細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05），ABCB1蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05）。
　　 3.食管癌耐藥細(xì)胞系Eca109/ABCG2的建立及其生物學(xué)特征的研究應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將pCDNA3.1（+）-ABCG2重組質(zhì)粒及空載體PCDNA3.1成功轉(zhuǎn)染入Eca109細(xì)胞中，并

10、應(yīng)用G418成功篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-ABCG2重組質(zhì)粒與空載體PCDNA3.1的陽(yáng)性克隆細(xì)胞分別記為Eca109/ABCG2、Eca109/PCDNA3.1細(xì)胞。
　　 MTT方法檢測(cè)結(jié)果顯示，阿霉素作用Eca109/ABCG2、Eca109/PCDNA3.1、Eca109細(xì)胞24h的IC50值分別為18.61±3.94、4.18±0.14、4.69±0.88，Eca109/ABCG2細(xì)胞耐藥性增加，相對(duì)于

11、Eca109細(xì)胞其耐藥指數(shù)為3.97。阿霉素作用Eca109/ABCG2細(xì)胞的IC50值與Eca109細(xì)胞比較，顯著增高（P<0.01），阿霉素作用Eca109/PCDNA3.1細(xì)胞的IC50值與Eca109細(xì)胞比較無(wú)差別（P>0.05）。DNR和MIT對(duì)Eca109/ABCG2細(xì)胞IC50值也分別增加，耐藥指數(shù)分別為3.50和3.15。
　　 Eca109/ABCG2細(xì)胞藥物外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Eca109/ABCG2細(xì)胞外排阿

12、霉素的作用較Eca109、Eca109/PCDNA3.1細(xì)胞顯著增加（P<0.01）。
　　 RT-PCR、Western-blot和FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，Eca109/ABCG2細(xì)胞中ABCG2mRNA和蛋白表達(dá)水平較Eca109/PCDNA3.1、Eca109細(xì)胞顯著升高（P<0.05）。
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示，Eca109/ABCG2細(xì)胞中ABCG2蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞膜及胞漿，與Eca109細(xì)胞相比，A

13、BCG2蛋白表達(dá)增高。
　　 4.青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)Eca109/ABCG2細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥作用及機(jī)制MTT結(jié)果顯示，Art與ADM聯(lián)合作用組與單獨(dú)用Art及ADM組相比，對(duì)Eca109/ABCG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均顯著增高（P<0.05）。
　　 Art與ADM聯(lián)合作用組與單獨(dú)應(yīng)用Art及ADM組相比，Eca109/ABCG2細(xì)胞凋亡率均顯著增高（P<0.05）。
　　 RT-PCR及FCM結(jié)果顯示，Art與ADM聯(lián)合

14、作用組與單獨(dú)用ADM組相比，Eta109/ABCG2細(xì)胞中ABCG2mRNA及蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。
　　 5.青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)裸鼠種植食管癌耐藥作用研究成功構(gòu)建人食管癌裸鼠種植瘤模型，成瘤率達(dá)100％。相同濃度的ADM組，接種Eca109/ABCG2細(xì)胞皮下種植瘤體積和重量與接種Eca109細(xì)胞皮下種植瘤相比均顯著增高（P<0.05）。Art與ADM聯(lián)合作用組與單獨(dú)應(yīng)用Art或ADM組相比，Eca109/ABCG2細(xì)

15、胞皮下種植瘤的體積及重量均顯著降低（P<0.05）。
　　 Art與ADM聯(lián)合作用組與單獨(dú)應(yīng)用ADM組相比，Eca109/ABCG2細(xì)胞皮下種植瘤中ABCG2mRNA及蛋白表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.在食管上皮癌變過(guò)程中，食管鱗癌組織中ABCB1及ABCG2表達(dá)明顯增高，且在食管不典型增生Ⅰ級(jí)至Ⅲ級(jí)之間呈逐漸增高趨勢(shì)，提示ABCB1和ABCG2過(guò)表達(dá)可能參與食管鱗癌發(fā)生以及耐藥性的

16、產(chǎn)生。ABCB1和ABCG2表達(dá)無(wú)相關(guān)性，提示ABCB1與ABCG2引起的耐藥可能具有不同的耐藥譜。ABCG2可能成為食管癌耐藥逆轉(zhuǎn)新的靶點(diǎn)。
　　 2.應(yīng)用ADM持續(xù)接觸濃度遞增誘導(dǎo)法，成功建立食管癌耐藥細(xì)胞Eca109/ADM。食管癌耐藥細(xì)胞Eca109/ADM高表達(dá)ABCB1和ABCG2，提示ABCB1和ABCG2參與了Eca109/ADM細(xì)胞耐藥的形成。青蒿琥酯可以提高ADM對(duì)Eca109/ADM細(xì)胞的殺傷作用。青蒿琥酯

17、可以降低Eca109/ADM細(xì)胞ABCG2表達(dá)而ABCB1表達(dá)無(wú)顯著差異，提示青蒿琥酯可以降低Eca109/ADM細(xì)胞ABCG2表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥。
　　 3.首次應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法建立多藥耐藥食管癌細(xì)胞株Eca109/ABCG2，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見相關(guān)報(bào)道。Eca109/ABCG2細(xì)胞具有ABCG2耐藥表型，能夠穩(wěn)定表達(dá)ABCG2蛋白，是研究ABCG2生物學(xué)特征良好的多藥耐藥細(xì)胞模型。
　　 4.首次初探青蒿琥酯逆

18、轉(zhuǎn)食管癌耐藥機(jī)制，國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。青蒿琥酯與ADM聯(lián)合應(yīng)用可以降低Eca109/ABCG2細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)，抑制ABCG2外排藥物的作用，增加細(xì)胞內(nèi)ADM含量，提高ADM對(duì)Eca109/ABCG2細(xì)胞殺傷作用，從而逆轉(zhuǎn)Eca109/ABCG2細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥。
　　 5.建立了食管癌耐藥細(xì)胞皮下種植瘤裸鼠模型，為研究食管癌耐藥提供理想的動(dòng)物模型。青蒿琥酯與ADM聯(lián)合應(yīng)用，能增強(qiáng)ADM在體內(nèi)抑制人食管癌耐藥細(xì)胞裸鼠皮