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文檔簡介
1、第一部分:人鼻咽癌標(biāo)本中多種耐藥基因的表達
目的:評估人鼻咽癌標(biāo)本中多種耐藥基因的表達,并初步探討多種耐藥基因的表達與治療療效之間的關(guān)系。
方法:收集2011年4月~2012年4月期間復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院鼻內(nèi)窺鏡室行鼻咽部新生物活檢的鼻咽部標(biāo)本,共172例,其中經(jīng)病理確診為鼻咽癌的標(biāo)本共75例。選擇在我院接受順鉑(Cisplatin,DDP)+5-氟尿嘧啶(Fluorouracil,5-FU)化療的病人,根據(jù)病
2、人的療效將其分為完全緩解(Complete remission, CR)和未完全緩解(nCR)。其中nCR共8例標(biāo)本。在CR中選擇8例病人作為A組,將8例nCR標(biāo)本作為B組。采用實時熒光定量PCR(Real time PCR)檢測標(biāo)本中多藥耐藥基因的表達情況。檢測基因包括:二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidinedehydrogenase,DPYD)、胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TYMP)、胸
3、腺肽合成酶(thymidylate synthase,TS)、乳清酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(orotatephosphoribosyl transferase,OPRT)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)、切除修復(fù)互補交叉基因1(excision repair crosscomplementing
4、 gene1,ERCC1)、表皮生長因子受體(epi dermal growth factorreceptor,EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug reslstance relation protein,MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白1(lung-resistance related protein1,LRP1)、乳腺
5、癌耐藥相關(guān)蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和拓撲異構(gòu)酶Ⅱα(topoisomeeraseⅡ,TOP2A)。比較A、B兩組標(biāo)本中多藥耐藥基因表達之間的差異,并初步探討多藥耐藥基因的表達和治療療效之問的關(guān)系。
結(jié)果:所有鼻咽癌標(biāo)本均不同程度表達多藥耐藥基因。B組鼻咽癌標(biāo)本相比A組而言, ERCC1和TS表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);其他基因表達差異不具有統(tǒng)計學(xué)意
6、義(P>0.05)。
結(jié)論:鼻咽癌組織中存在多種多藥耐藥基因的表達,可能是影響鼻咽癌化療療效的重要因素。鼻咽癌的治療療效可能跟ERCC1和TS的表達呈負相關(guān)。
第二部分:人鼻咽癌耐順鉑細胞系的建立及其生物學(xué)特性研究
目的:建立人鼻咽癌耐順鉑(DPP)細胞系HNE1/DDP,并研究其生物學(xué)特性,為后續(xù)體外研究腫瘤耐藥構(gòu)造模型。
方法:以DDP為誘導(dǎo)干預(yù)藥物,以人鼻咽癌細胞HNE1為親代細胞系,采用了
7、大劑量沖擊法與逐步增加劑量法相結(jié)合的方法,在培養(yǎng)基中逐漸增加DDP的濃度,體外連續(xù)培養(yǎng),建成一株人鼻咽癌耐順鉑的細胞系,并命名為HNE1/DDP。比較兩種細胞對鼻咽癌常用化療藥物順鉑,卡鉑,5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)和紫杉醇的毒性,觀察耐藥細胞和親本細胞之間形態(tài)差異,制作生長曲線,并檢測兩種細胞的遷移和侵襲能力。
結(jié)果:我們歷時1年的時間成功地建立了人鼻咽癌耐順鉑細胞系HNE1/DDP,該細胞能在含
8、DDP1ug/ ml的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長并傳代,其對DDP的耐藥指數(shù)為14.75,并與卡鉑、5-FU和紫杉醇等多種鼻咽癌常用的化療藥物可以產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥;耐藥細胞HNE1/DDP相比親本細胞HNE1增殖速度稍有下降,體外群體倍增時間(doubling time,TD)較親代細胞稍微延長(41.85 h VS37.44 h);但這兩種細胞在遷移和侵襲能力方面無明顯差別。
結(jié)論:成功建立了能在含1ug/ml的順鉑培養(yǎng)液中穩(wěn)定
9、生長和傳代的人鼻咽癌耐順鉑細胞系HNE1/DDP,該細胞具有多藥耐藥性,其生物學(xué)特性與親本細胞基本相似,能作為體外研究腫瘤耐藥的模型。
第三部分:鼻咽癌細胞多藥耐藥的表達及藥物逆轉(zhuǎn)研究
目的:探討鼻咽癌耐順鉑細胞HNE1/DPP和親本細胞HNE1之間多藥耐藥表達的差異,并初步研究利多卡因?qū)NE1/DPP細胞的藥物逆轉(zhuǎn)作用。
方法:采用RT-PCR,免疫熒光(Immunofluorescence,IF)和W
10、estern-Blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測鼻咽癌耐順鉑細胞HNE1/DPP和親本細胞HNE1之間多種多藥耐藥的表達。檢測的指標(biāo)如下,二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidinedehydrogenase,DPYD)、胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TYMP)、胸腺肽合成酶(thymidylate synthase,TS)、乳清酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(orotatephosphoribosy
11、l transferase,OPRT)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)、切除修復(fù)互補交叉基因1(excision repair cross complementing gene1,ERCC1)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)
12、、血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug reslstance relation protein,MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白1(lung-resistancerelated Protein1, LRP1)、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和拓撲異構(gòu)酶Ⅱα(topois
13、omeeraseⅡ,TOP2A)。同時采用線粒體膜電位法(JC-1),活性氧(ROS)檢測法和流式細胞儀檢測凋亡法(Annexin V-FICT/PI)初步探索利多卡因逆轉(zhuǎn)HNE1/DPP細胞對順鉑的耐藥性。
結(jié)果:RT-PCR,IF和Western-Blot結(jié)果顯示,多藥耐藥基因在鼻咽癌耐順鉑細胞HNE1/DPP和鼻咽癌細胞HNE1中均有不同程度表達,且多種多藥耐藥基因表達存在差異。在培養(yǎng)液中加入小于毒副作用的利多卡因后,H
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