HAAH基因的克隆表達(dá)及其在食管癌檢測(cè)中的研究.pdf

1、背景：近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)研究報(bào)道人天冬氨酸鹽β羥化酶（HumanAspartyl/Asparaginyl β-Hydroxylase，HAAH）在多種類(lèi)型癌癥組織及腫瘤細(xì)胞系中存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，而在相應(yīng)的正常組織中卻不表達(dá)或低表達(dá)，這預(yù)示其較高的診斷價(jià)值。但在食管癌中該基因的研究還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌組織中該基因的表達(dá)情況，以初步評(píng)估其診斷價(jià)值。另一方面由于目前該蛋白的抗體仍未商品化，因此實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該蛋白，為抗體的制備

2、及檢測(cè)工作打下基礎(chǔ)。
　　 方法：利用半定量RT-PCR 實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)23例手術(shù)切除的食管癌組織及23例癌旁組織樣本進(jìn)行HAAH mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 根據(jù)GeneBank公開(kāi)發(fā)表的HAAH cDNA 序列設(shè)計(jì)引物，用PCR 方法擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框架內(nèi)642 bp的DNA 片段，并將該片段定向插入到原核表達(dá)載體pET-17b中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。將PCR、酶切鑒定及測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)

3、粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliRosetta(DE3)中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE 檢測(cè)分析。對(duì)重組蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)表達(dá)重組蛋白進(jìn)行可溶性分析。在變性條件下利用Ni-NTA 凝膠親和層析純化重組蛋白。以重組蛋白作為抗原注射小鼠制備抗血清，利用Western blot 驗(yàn)證重組蛋白的免疫原性。將純化的重組蛋白直接包被酶標(biāo)板，利用間接ELISA的方法對(duì)16例食管癌病人及16例正常對(duì)照者血清中HAAH 自身抗體進(jìn)

4、行檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)檢測(cè)方法的診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。
　　 結(jié)果：HAAH mRNA在23例食管癌組織中均呈現(xiàn)表達(dá)，而在癌旁組織中有4例表達(dá)缺失，利用半定量分析其在癌組織和癌旁組織中的的表達(dá)水平值分別為0.690±0.236和0.306±0.159，癌癥組織顯著高于癌旁組織（P<0.01）。經(jīng)受試者特征(ROC)曲線(xiàn)分析，癌癥組織樣本中HAAH基因的高表達(dá)率73.9％（17/23），而在癌旁組織中僅為13.0％（3/23）。
　　

5、 獲得642 bp HAAH 編碼序列的DNA 片段，將該基因插入原核表達(dá)載體pET-17b中，成功構(gòu)建HAAH 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)pET-17b-HAAH/Rosetta(DE3)。SDS-PAGE 顯示該重組表達(dá)菌能高效表達(dá)出25 kDa 左右的融合蛋白，分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致。通過(guò)改變IPTG的濃度，溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，確定了表達(dá)基因的最佳誘導(dǎo)條件：IPTG 終濃度為0.4 mmo1/L，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，誘導(dǎo)溫度為27℃。經(jīng)定位分析，

6、目的蛋白以包涵體的形式存在。在變性條件下用Ni-NTA 凝膠親和層析法獲得了高純度的融合蛋白。利用免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清，經(jīng)Western blot 驗(yàn)證重組蛋白具有很好的免疫原性。間接ELISA法檢測(cè)16例食管癌病人和16例正常人血清中HAAH 自身抗體的OD450 值分別為0.168±0.042和0.107±0.033，食管癌病人組血清抗體水平明顯高于正常人，P<0.01。ROC曲線(xiàn)分析表明，當(dāng)選OD450=0.156 為cutoff