基于ABCG2及EGFR表達的肺癌細胞系中SP細胞的藥物敏感性的初步研究.pdf

1、一.研究背景與目的： 目前由于有計劃、合理地綜合應(yīng)用現(xiàn)有的幾種治療手段，肺癌的5年生存率有所提高，但仍有大部分病人死于局部復(fù)發(fā)或者遠處轉(zhuǎn)移。令人困惑的是這些情況又是手術(shù)、放療及化療等傳統(tǒng)治療所不能有效解決的。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在一群數(shù)量少，但具有自我更新以及多向分化等一系列正常干細胞特征的細胞，且這類細胞具有很強致瘤性，這群細胞被命名為腫瘤干細胞(cancer stem cells or tumor stem cells

2、，CSCs or TSCs)。從體外小鼠模型上得到啟示，這類細胞有可能為腫瘤復(fù)發(fā)、分化及轉(zhuǎn)移的重要原因[7]。 SP細胞(side population cell，SP cell，側(cè)群細胞)是利用DNA熒光染料Hoechst33342和流式細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)的特殊細胞亞群，它們也具有自我更新、多向分化能力等一系列干細胞的生物學特征。目前已有報道在人體除造血系統(tǒng)外的多種正常組織和一些實體腫瘤中分離得到SP細胞，初步闡明了SP細胞的一系

3、列生物學特征。但是迄今為止對人類肺癌中SP細胞的相關(guān)研究仍處于起步階段。 隨著對腫瘤干細胞研究的不斷深入，在不同腫瘤細胞系以及原代組織標本中發(fā)現(xiàn)SP細胞的報道越來越多，但由于缺乏明確而統(tǒng)一的特異性細胞分型標記，在實體瘤干細胞的分離鑒定方面卻存在著很大的困難。而利用SP細胞分離技術(shù)，研究腫瘤細胞中SP細胞的相關(guān)特性，將有助于人們了解真正的實體腫瘤干細胞，為腫瘤治療提供新的指引。 二.研究方法： 將生長狀態(tài)良好的肺癌

4、細胞株經(jīng)DNA熒光染料Hoechst—33342染色后進行流式細胞儀無菌分選，分別收集熒光陽性的Non—SP(non side population cell，Non—SP cell，非側(cè)群細胞)細胞和熒光陰性的SP細胞。收集分選后培養(yǎng)一段時間的細胞，經(jīng)過ABCG2抗體標記后上流式細胞儀分析，驗證SP及Non—SP細胞表面ABCG2抗原表達。同時利用流式細胞儀測定SP及Non—SP細胞表面EGFR家族各成員蛋白表達。經(jīng)過以上方法后，我們

5、以MTT方法檢測臨床上常用的化療藥及靶向藥物對SP細胞及Non—SP細胞的細胞毒作用。觀察它們的反應(yīng)性差別，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 三.結(jié)果： 肺癌細胞株Glc—82中熒光陰性的SP細胞比例為14.5％，其他均為Hoechst33342熒光陽性的Non—SP細胞。對照組經(jīng)過Verapamil處理后發(fā)現(xiàn)SP細胞降低到3.6％。收集分選后培養(yǎng)一段時間的細胞，經(jīng)過ABCG2抗體標記后上流式細胞儀分析，發(fā)現(xiàn)SP細胞表面ABCG

6、2抗原陽性的細胞達到2.5％，而Non—SP細胞中該抗原陽性的只有0.6％，差異明顯(P<0.05).利用流式細胞儀測定SP及Non—SP細胞表面EGFR蛋白表達，發(fā)現(xiàn)除c—erbB1表達在SP細胞中(1.33％)高于Non—SP細胞表達(0.7％)外，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。其他成員cerbB2-4均無明顯的統(tǒng)計學差異。我們用臨床上常用的化療藥及靶向藥物進行實驗，分為六組進行：以MTT實驗檢測各藥：carboplatin組、c

7、isplatin組、Lapatinib組、vinorelbine組、Paclitaxel組及docetaxel組對SP細胞及Non—SP細胞的細胞毒作用。結(jié)果表明，各組化療藥對SP細胞的抑制作用均小于Non—SP細胞，重復(fù)測三次數(shù)值并行配對T檢驗(P<0.002)。同時采用MTT法重復(fù)三次測每組IC50值(圖2.1.4 G)，并行配對T檢驗差異顯著(P<0.05)。采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析 四.結(jié)論： 本論文初

8、步探索利用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS)的技術(shù)，基于ABCG2和EGFR蛋白表達在中國人肺腺癌細胞系Glc—82中的特點，研究腫瘤干細胞樣SP細胞藥物敏感性及得出以下結(jié)論： 一、中國人肺腺癌細胞系Glc—82中存在SP細胞亞群。其表面ABCG2分子高表達于Non—SP細胞。 二、中國人肺腺癌細胞系Glc—82中SP細胞普遍對化療藥及EGFR靶向藥物耐藥。