MACC1基因在肺癌組織及肺癌細胞系中的表達研究.pdf

1、目的：MACC1（metastasis-associatedincoloncancerl，MACC1）基因是2009年發(fā)現(xiàn)的與結腸癌轉移、侵襲相關的新基因。研究顯示，MACC1基因作為肝細胞生長因子HGF/MET信號通路的一個關鍵的調節(jié)因子在結腸癌的侵襲和轉移中發(fā)揮著重要作用，而且與預后呈負相關。MACC1可以與MET啟動子結合，上調結腸癌中MET的表達，促進腫瘤細胞的運動和增殖；MACC1基因在HGF誘導的腫瘤轉移、侵襲中亦發(fā)揮重要作

2、用。作為一個新發(fā)現(xiàn)的基因，目前為止，MACC1表達水平與肺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉移的關系尚不明確。因此，我們擬通過免疫組織化學染色和Westernblot分別檢測肺癌組織和肺癌細胞系中MACC1的表達。我們前期試驗發(fā)現(xiàn)MACC1在肺癌細胞株SBC-5中高表達。因此擬通過構建MACC1基因特異性的真核表達干涉載體，轉染肺癌細胞系SBC-5，篩選出MACC1基因表達下調明顯的穩(wěn)定轉染細胞系。進而檢測MACC1表達下調對肺癌細胞系SBC-5體外

3、增殖活性、細胞遷移的影響，從而為MACC1分子成為肺癌治療的新靶點提供實驗性研究基礎。
　　方法：（1）采用免疫組織化學法檢測63例肺組織（包括正常肺組織和肺腺癌組織）中MACC1蛋白的表達情況；Westernblot法檢測4種肺癌細胞系中MACC1蛋白表達。（2）設計并化學合成兩對MACC1（metastasis-associatedincoloncancerl，MACC1）基因特異的發(fā)夾結構小RNA，并且在BLAST中對靶序列

4、進行同源性分析，退火后連接到pSilencer4.1-CMVneo載體中，構建MACC1基因特異性真核表達干涉載體。通過限制性酶切及測序方法鑒定重組載體。將MACC1基因特異的干涉表達載體及無關干涉載體分別命名為MACC1/shRNA-1、MACC1/shRNA-2、MACC1/shRNA-NC。（3）分別將MACC1基因特異性的干涉表達載體及無關干涉對照載體經陽離子脂質體LipofectamineTM2000轉染肺癌細胞系SBC-5細

5、胞，經G418篩選兩周后獲得穩(wěn)定轉染的細胞。（4）通過RT-PCR和Westernblot法分別檢測轉染后SBC-5細胞中MACC1mRNA和蛋白表達情況。（5）MTT法和克隆形成試驗檢測轉染干涉載體組SBC-5細胞體外生長增殖狀況；劃痕試驗觀察轉染干涉載體組SBC-5細胞遷移能力的變化。
　　結果：（1）免疫組織化學結果顯示，肺腺癌組織中MACC1蛋白表達陽性率為38.3％；MACC1蛋白在肺癌SBC-5細胞系中高表達，而在肺癌

6、A549、PC14、SBC-3中幾乎檢測不到表達。（2）限制性酶切和測序方法鑒定結果證實，針對MACC1基因的真核表達干涉載體構建成功。（3）分別將MACC1/shRNA-1、MACC1/shRNA-2、MACC1/shRNA-NC經陽離子脂質體LipofectamineTM2000轉染肺癌細胞系SBC-5，經G418篩選兩周后得到穩(wěn)定轉染的細胞分別命名為SBC-5-S1、SBC-5-S2、SBC-5-NC。（4）同轉染MACC1/sh

7、RNA-NC及未轉染組細胞相比，穩(wěn)定轉染MACC1/shRNA-1的SBC-5-S1細胞中MACC1mRNA和蛋白表達水平分別抑制了約68.5％和58.5％，而在穩(wěn)定轉染MACC1/shRNA-2的SBC-5-S2細胞中則沒有明顯變化，故選擇SBC-5-S1細胞用于下一步試驗。（5）MTT和克隆形成試驗結果顯示，SBC-5-S1細胞的增殖活性明顯降低（P<0.05）；劃痕試驗觀察到SBC-5-S1細胞的增殖、遷移能力明顯減弱。