SCIN基因在肺癌中的表達(dá)及其促進(jìn)細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、目的:肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡數(shù)最高的惡性腫瘤。據(jù)預(yù)計(jì)，2015年全國新診斷癌癥病例429萬，癌癥導(dǎo)致死亡病例281萬例，其中肺癌在這兩項(xiàng)數(shù)據(jù)均列各項(xiàng)腫瘤之首。生存分析結(jié)果顯示我國肺癌總體5年生存率僅為16.1％，遠(yuǎn)低于美國肺癌總體21％的5年生存率。侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌患者預(yù)后不良的重要原因，因此更好的理解肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)更有效的治療是至關(guān)重要的。
　　我們一直關(guān)注于尋找適合于臨床應(yīng)用的、更具特異性和靈敏性的分子標(biāo)志

2、物，應(yīng)用于肺癌的輔助或聯(lián)合診斷，對(duì)指導(dǎo)肺癌臨床分子分期及個(gè)體化治療提供有效的幫助。在前期工作中，我們在肺癌中檢測到了一個(gè)具有突出意義的分子肌切蛋白SCIN(Scinderin)。我們選取臨床肺腺癌組織標(biāo)本，通過表達(dá)譜芯片檢測、生物信息學(xué)分析、高通量篩選等實(shí)驗(yàn)，首次篩選出SCIN可能是肺腺癌的驅(qū)動(dòng)基因。通過文獻(xiàn)回顧，我們發(fā)現(xiàn)SCIN是一種依賴于鈣離子的切斷和限制性的肌動(dòng)蛋白，屬于凝乳膠蛋白超家族。這一類超家族蛋白負(fù)責(zé)控制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)

3、力學(xué)，并且參與一系列肌切蛋白的相關(guān)過程中。SCIN以Ca2+端依賴的方式調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白纖維被切斷、重建先前存在的肌動(dòng)蛋白絲，限制細(xì)絲末端和成核肌動(dòng)蛋白聚合單體。SCIN主要表達(dá)在內(nèi)分泌和分泌細(xì)胞，并且在囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞膜下組織細(xì)胞骨架中的胞吐過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，SCIN被認(rèn)為是一個(gè)具有多種功能的可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成等細(xì)胞功能和破骨細(xì)胞功能的分子，參與到原巨核細(xì)胞的分化，增殖和遷移。腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞遷移過程密不可分，而這一過程

4、就包括受各種肌動(dòng)蛋白聯(lián)結(jié)的蛋白質(zhì)調(diào)控的肌動(dòng)蛋白絲動(dòng)力學(xué)。
　　最近的研究表明，SCIN在癌癥細(xì)胞中高度表達(dá)，而且其表達(dá)與細(xì)胞增殖有關(guān)。SCIN高度表達(dá)在人類前列腺癌組織和生物細(xì)胞系中，在敲減SCIN后可抑制細(xì)胞增殖和使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，在人類膀胱癌細(xì)胞系HT1376中，SCIN是順鉑耐藥性的提示因子。在人類胃癌細(xì)胞系SLC7901中，敲減SCIN后可以有效地減少細(xì)胞增殖和遷移。在體外，沉默SC

5、IN可以有效的抑制人類胃癌細(xì)胞(GC)的遷徙和侵入能力，抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。
　　基于以上背景和工作基礎(chǔ)，我們提出假設(shè)，SCIN基因可能在促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。
　　研究方法:在前期研究基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)行下列研究:
　　(1) SCIN基因表達(dá)與肺癌臨床相關(guān)性研究
　　通過回顧性收集保存于我院病理科的有術(shù)后5年生存資料的39例肺癌患者的標(biāo)本，免疫組化染色檢測SCIN在癌組織和癌旁2厘米肺組織中的表達(dá)差異。根

6、據(jù)臨床病例資料，應(yīng)用Cox回歸分析、Kaplan-Meier生存分析、單因素、多因素分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析SCIN表達(dá)與腫瘤TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、肺癌高危因素（如吸煙史等）、患者生存等的相關(guān)性。
　　(2)進(jìn)一步證實(shí)SCIN對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖功能的影響
　　采用人肺癌細(xì)胞株A549和H1299體外培養(yǎng)。慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默SCIN，通過Western blot檢測SCIN的表達(dá)，比較SCIN表達(dá)的差異情況;

7、通過MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)SCIN在肺癌細(xì)胞增殖中的功能。
　　(3) SCIN在肺癌中發(fā)揮增殖作用的分子機(jī)制及信號(hào)通路研究
　　對(duì)A549、H1299細(xì)胞株進(jìn)行慢病毒介導(dǎo)的RNAi，方法同研究內(nèi)容(1)，進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測及生物信息學(xué)分析，尋找SCIN在肺癌增殖中發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號(hào)通路和分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.我們分析了39例肺癌患者的組

8、織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)相比于癌旁組織（陽性率12.5％），SCIN在肺癌組織中呈特異性高表達(dá)，陽性率達(dá)到了82.1％（P＜0.01）。進(jìn)一步應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析SCIN表達(dá)狀態(tài)與總生存的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)SCIN高表達(dá)患者的總生存比SCIN低表達(dá)患者明顯更短，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.在A549和H1299細(xì)胞系中采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi將SCIN基因沉默后，與對(duì)照組相比，MTT法發(fā)現(xiàn)SCIN-shRNA組

9、細(xì)胞增殖情況受到抑制（P＜0.01）;克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)克隆形成能力顯著下降(P＜0.01)。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，SCIN基因沉默后，兩株細(xì)胞系中處于G0/G1期和G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加，而處于S期的細(xì)胞明顯減少，說明SCIN基因?qū)?xì)胞周期起到調(diào)控作用(P＜0.05);而SCIN-shRNA組中凋亡細(xì)胞的比例較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)。
　　3.在A549細(xì)胞中，RNA干擾SCIN基因后，檢測RTK信號(hào)通路中相關(guān)基因，