外源基因在真核細胞中的表達

1、外源基因在真核細胞中的表達,基因的體外重組和表達體系最早是利用大腸桿菌作為宿主，以后逐漸發(fā)展到真核生物細胞作為宿主，如酵母、植物細胞和動物細胞等。以植物細胞作為轉(zhuǎn)化受體，不僅能把一些植物基因或DNA片段作為外源基因轉(zhuǎn)化到受體植物，而且能把動物或微生物中存在的基因轉(zhuǎn)化并整合到植物基因組中，使其在植物細胞中表達。,外源基因在真核生物細胞中的表達，對于分子生物學(xué)理論研究，對真核生物基因表達調(diào)控的探討提供了其他試驗方法難以達到的有力手段。

2、 外源基因如何才能轉(zhuǎn)入真核細胞？又如何能從數(shù)量龐大的細胞群體中篩選出遺傳轉(zhuǎn)化的細胞？又是如何對轉(zhuǎn)化的真核生物進行鑒定？,,一、選擇標記基因和報告基因： 1. 基因轉(zhuǎn)化的選擇標記 選擇標記一般是一種基因，即選擇標記基因，他在轉(zhuǎn)化前與待轉(zhuǎn)化外源基因相連接，當(dāng)把已轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的細胞群體置于加有選擇劑的（抗生素）的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)時，已轉(zhuǎn)化的細胞群體或再生植株由于帶有選擇標記基因，該基因的產(chǎn)物---酶能分解培

3、養(yǎng)基中加入的選擇劑，因此，轉(zhuǎn)化細胞對選擇劑具有抵抗能力，不受選擇劑毒害而正常地生長，發(fā)育。相反未轉(zhuǎn)化細胞或再生植株受培養(yǎng)基中選擇劑的毒害，而不能存活下來而被淘汰。,（1）新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ） Npt Ⅱ 基因表達產(chǎn)生的酶可催化許多氨基葡萄糖苷類抗生素（如新霉素，慶大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化，使抗生素失去對細胞的毒性，這

4、是由于磷酸化的抗生素不能與植物細胞葉綠體和線粒體中的核糖體30S亞基結(jié)合，進一步影響70S起始復(fù)合體合成，干擾線粒體和葉綠體的蛋白質(zhì)生物合成，使植物細胞最終死亡，因此，與外源基因結(jié)合的Npt基因轉(zhuǎn)化細胞后，就可在含有抗生素的培養(yǎng)基上存活下來。,（2）二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolate reductase，Dhfr） 二氫葉酸還原酶為真核細胞核苷酸合成所必需，而氨甲喋呤（mathotrexate，MTX）作為競爭性抑

5、制劑抑制Dhfr酶的活性，當(dāng)培養(yǎng)基中存在MTX時，則由于植物細胞中不能合成四氫葉酸而抑制生長。 有一種Dhfr的突變酶，它與氨甲喋呤的親和力較正常酶降低260倍，突變酶不為MTX所抑制，抗MTX，將編碼該酶的基因與CaMV35S啟動子拼接后導(dǎo)入植物細胞，則轉(zhuǎn)化植物細胞能在含有MTX的培養(yǎng)基上正常生長。相反，未轉(zhuǎn)化植物細胞，其Dhfr對培養(yǎng)基中的MTX十分敏感，而不能存活。,（3）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hpt） 潮霉素B作

6、為一種抗生素對大多數(shù)植物均有毒性，但當(dāng)潮霉素B被細菌中分離到的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶催化而磷酸化時，其毒性喪失。利用這一特性，可以把hpt作為選擇標記，即把htp基因和適合植物的強啟動子構(gòu)建成嵌合基因，轉(zhuǎn)化受體植物，轉(zhuǎn)化有htp基因的植物細胞能表達出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，使培養(yǎng)基中的潮霉素B磷酸化而失去毒性，反之，未轉(zhuǎn)化該基因的細胞則被潮霉素毒害致死。 除了以上3種常用的選擇標記基因之外，還有慶大霉素抗性基因，鏈霉素抗性基因等抗生素

7、類選擇標記，此后，又發(fā)展出非抗生素選擇標記，如抗草甘膦類除草劑基因等。,2. 報告基因 報告基因是指用于檢測組裝的嵌合基因在導(dǎo)入細胞后是否具有功能的一種指示基因，它通常是編碼在離體條件下易于檢測的酶。 具體是將報告基因連接在待研究的目的基因的啟動子的下游，其后再連接真核生物的終止信號，然后將構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)化受體細胞，組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育的不同階段，不同器官和組織乃至細胞，分析其中的報告基因產(chǎn)物-酶活性

8、，從而了解該目的基因在何時、何處表達。 作為報告基因，其表達產(chǎn)物及產(chǎn)物的類似功能在未轉(zhuǎn)化細胞中原本并不存在。,（1）β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase gene，Gus） Gus基因是編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的基因，最初為細菌中分離的uid A基因，后被應(yīng)用于植物細胞轉(zhuǎn)化，Gus基因的廣泛應(yīng)用，一方面是其測定方法簡單、靈敏、植物內(nèi)源背景活性低。另一方面是由于它既可以通過熒光分光光度計進行定量分析，又可以進行

9、組織化學(xué)染色定位。 熒光法測定β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，一般用于測定Gus基因在原生質(zhì)體中的瞬間表達，或測定Gus基因在穩(wěn)定完整細胞中的表達。測定時以4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide ）為底物，在Gus酶催化下，生成4-甲基傘形酮和β-D-葡萄糖醛酸。當(dāng)4-甲基傘形酮的羥基解離后可被365nm波長的光激發(fā)，從而產(chǎn)生455nm熒光，在熒光分光光度計上進行定量分析。,原位

10、組織化學(xué)定位應(yīng)用于對穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物進行Gus融合基因時空表達模式的精確分析，方法是用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β–葡糖醛酸，5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid）作為底物，把待檢測材料浸泡在含有底物的緩沖液中保溫，在組織、細胞、原生質(zhì)體被Gus轉(zhuǎn)化的部位，Gus酶切割葡萄糖醛酸部分，產(chǎn)生無色的吲哚氧基中間產(chǎn)物，隨后經(jīng)氧化二聚作用形成5，5'-二溴-4，4'

11、;-二氯靛藍的藍色沉淀，經(jīng)顯微鏡鏡檢，觀察Gus活性部位，繼而了解嵌合基因表達的組織化學(xué)定位。 該方法檢測要注意排除假陽性存在的可能，有人對52中植物的內(nèi)源Gus活性進行測定，發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)生長階段沒有內(nèi)源Gus活性，而在繁殖器官如胚、胚乳、果實種子、種皮中均有明顯的內(nèi)源活性，而隨著種子萌發(fā)又逐漸消失。,（2）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ chloroamphenicol acetyltransferase，Cat） Cat基因來自細

12、菌轉(zhuǎn)座子Tn9，它編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，以氯霉素為底物，使氯霉素乙酰化而先后生成3-乙酰氯霉素、1-乙酰氯霉素和1.3-二乙酰氯霉素。乙酰化的氯霉素不再對植物細胞產(chǎn)生毒性，故可作為選擇標記。乙?；磻?yīng)產(chǎn)物采用薄層層析法分離，放射自顯影檢測各種乙酰化產(chǎn)物在層析位置的放射強度。,（3）熒光素酶基因（luciferase gene） 多取自螢火蟲和細菌細胞。反應(yīng)底物為熒光素，在ATP和Mg2+存在下，酶促氧化脫羧，生成激

13、活態(tài)氧化熒光素發(fā)射光子，產(chǎn)生熒光，熒光強弱可以通過熒光計測定，也可作X-光片直接檢測。 熒光素+ATP+O2 氧化熒光素+AMP+PPi+CO2+光,,（4）綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因 gfp基因是從維多利亞水母中分離純化的一種可以發(fā)出綠色熒光的物質(zhì)。GFP為238個氨基酸的小蛋白，發(fā)色團能吸收可見光而發(fā)射熒光，用熒光顯微鏡可檢測到GFP產(chǎn)生的綠色熒光。GFP檢

14、測不需要添加任何底物或輔助因子，不使用同位素，不需要測定酶的活性等優(yōu)點，且在原核和真核生物中都能表達，表達產(chǎn)物對細胞無毒性。,二、植物基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 植物基因轉(zhuǎn)移也稱為遺傳轉(zhuǎn)化（genetic transformation），是指利用重組DNA技術(shù)，細胞培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移技術(shù)，將外源基因?qū)胫参锛毎蚪M織，獲得轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)。,將外源基因成功轉(zhuǎn)入植物細胞中，需要考慮3個方面：如何使外源基因進入細胞？2. 進入植物細

15、胞的基因是整合到基因組中，還是滯留在細胞之中？3. 用于轉(zhuǎn)化的外植體是否能夠再生？,植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是在1974年發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的基礎(chǔ)上形成的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，1983年獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1985年Horsch首創(chuàng)了葉盤法（leaf disc transformation），1987年，康乃爾大學(xué)研究者設(shè)計出基因槍；1987年，Jefferson等人提出GUS（葡糖苷酸酶）基因融合系統(tǒng)，作為報告基因。,,目前已發(fā)展出多種遺傳轉(zhuǎn)化方

16、法，包括物理方法、化學(xué)方法以及生物學(xué)方法。其中以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛，占約80％。 轉(zhuǎn)化的目的基因包括各種抗病、抗蟲、抗除草劑、延遲保鮮、改變花色花型、改良品質(zhì)以及疫苗等基因。,轉(zhuǎn)化方法可以劃分為直接基因轉(zhuǎn)移和間接基因轉(zhuǎn)移。（一）直接基因轉(zhuǎn)移： 采用物理或化學(xué)的方法將外源目的基因轉(zhuǎn)移到植物細胞，并整合到染色體DNA上的技術(shù)。包括電激法、基因槍法、超聲波法、真空滲入法、PEG法、磷酸共沉淀法、微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法

17、等。,1、電激法：利用高壓電脈沖把外源基因?qū)胫参锛毎麑崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化的方法。 1985年由斯坦福大學(xué)Fromm M等最先將CAT基因通過電激法導(dǎo)入胡蘿卜、煙草、玉米的原生質(zhì)體，測得瞬間表達。隨后康乃爾大學(xué)將外源基因?qū)朐|(zhì)體實現(xiàn)穩(wěn)定表達。 轉(zhuǎn)化率隨質(zhì)粒DNA濃度、電脈沖強度以及持續(xù)時間增加而增加。,2、基因槍法（particle bombardment） ：是利用高速微彈粒將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細胞或組織中的方法，也稱為微彈射擊

18、法、粒子轟擊法等。 最早由Klein TM在1987年創(chuàng)立，并將煙草花葉病毒RNA和CAT基因(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)導(dǎo)入洋蔥表皮細胞。 系統(tǒng)將帶有包裹有目的基因的金屬顆粒（金?；蜴u粒），以很高的速度轟擊植物細胞，由于小顆粒穿透力強，故不需除去細胞壁和細胞膜而進入基因組，從而實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的目的。,基因槍由激發(fā)器、槍管、擋板和無菌小室等組成。將一定量的帶有目的

19、基因的質(zhì)粒DNA，CaCl2、亞精胺與鎢粒一起離心或振蕩，可將目的基因吸附于鎢粒，通過基因槍把鎢粒以430米/秒的速度轟擊目標，使目的基因穿過細胞壁和細胞膜進入受體細胞。,3、超聲波法： 根據(jù)超聲波的空化作用，把外源基因?qū)胧荏w細胞。1990年許寧等把GUS基因通過該方法導(dǎo)入了小麥幼穗愈傷組織。,4、聚乙二醇法（PEG）： PEG（polyethylene）具有細胞粘合作用和擾亂細胞膜的磷脂雙分子層的作用。1980年由Dar

20、ey最早利用該方法將外源基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體。 1985年以后利用該方法將報告基因轉(zhuǎn)入種植物原生質(zhì)體，獲得瞬間表達或穩(wěn)定表達。 PEG法轉(zhuǎn)化率低，一般在10-5-10-6。,5、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法： 利用磷酸堿或磷酸絲氨酸等脂質(zhì)構(gòu)成的雙層膜囊，可以包裹質(zhì)粒，DNA大分子、病毒顆粒等，通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體融合將外源基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體細胞，或通過注射法實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。6、真空滲入法： 利用真空作用使外源基因進入植物體，細胞并實現(xiàn)DN

21、A的整合。,7、顯微注射法： 利用顯微裝置將質(zhì)粒DNA注射入宿主細胞的方法。利用極細(1μm)的玻璃毛細管裝入待轉(zhuǎn)移的外源DNA，然后在顯微鏡下直接將毛細管插入原生質(zhì)體等細胞，并注射DNA。,（二）間接基因轉(zhuǎn)移： 某些病原生物（農(nóng)桿菌、病毒等）能夠通過感染宿主細胞，將病原生物DNA整合到宿主細胞基因組中，因此改造病原DNA，利用其侵染能力，能將外源基因?qū)胫参锘騽游锛毎?，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。 以農(nóng)桿菌或病毒為載體的基因轉(zhuǎn)移

22、過程稱為間接基因轉(zhuǎn)移。,1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：（1）Ti質(zhì)粒： 革蘭氏陰性農(nóng)桿菌（Agrobacterium Tumefaciens）中存在的一種質(zhì)粒DNA。具有一段T－DNA能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入植物染色體DNA中并實現(xiàn)整合。,Ti質(zhì)粒約200Kb，一半序列參與質(zhì)粒復(fù)制、冠癭堿代謝和接合作用；對致瘤不起作用，另一半序列包括T－DNA區(qū)和毒性區(qū)（Vir region）。 T－DNA：章魚堿型農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T－DNA由兩部

23、分組成，一部分與致瘤有關(guān)，稱為左轉(zhuǎn)移DNA（TL－DNA），另一部分與致瘤無關(guān)，稱為右轉(zhuǎn)移DNA（TR－DNA）。 TL－DNA含有編碼合成激素類和冠癭堿類的基因，由于激素基因在植物細胞內(nèi)的表達，產(chǎn)生了過量的生長素和細胞分裂素，破壞了內(nèi)源激素平衡，而導(dǎo)致植物細胞發(fā)生癌變。,Vir區(qū)：是T－DNA以外涉及誘發(fā)腫瘤的區(qū)域，在Ti質(zhì)粒的物理圖上位于T－DNA左側(cè)，長30－40Kb，Vir區(qū)并不整合入植物基因，但卻是T－DNA轉(zhuǎn)移所必需

24、。T－DNA邊界序列：T－DNA長約23Kb，但在其兩端邊界各有一個25bp的正向重復(fù)序列，高度保守，一般認為右端重復(fù)序列對T－DNA轉(zhuǎn)移起重要作用。,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞的機理：（1）農(nóng)桿菌對植物傷口的附著； 植物傷口釋放出信號分子。如乙酰丁香酮（AS）以及羥基乙酰丁香酮（OHAS）等。,（2）Vir區(qū)基因表達的誘導(dǎo)； VirA以及VirG基因在酚類物質(zhì)的誘導(dǎo)下得到表達。（3）T－DNA中間體和T－鏈蛋白復(fù)合體的形成；

25、 VirD1和VirD2蛋白表達與T－DNA邊界重復(fù)序列結(jié)合解纏繞與切割，VirC1和VirC2參與下，形成T－DNA轉(zhuǎn)移中間體。并以DNA－蛋白質(zhì)復(fù)合體形式存在和轉(zhuǎn)移。VirE1和VirE2參與該過程。,（4）T－鏈蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)移至植物細胞； T－鏈蛋白復(fù)合體（T－鏈、VirD2、VirE2）在VirB基因表達產(chǎn)物作用下，穿越細胞膜，VirB操縱子具有11個基因，產(chǎn)物定位于細胞膜上并形成一種膜結(jié)合T－復(fù)合體運輸器，其中VirD2

26、和VirE2蛋白分別具有導(dǎo)航和核定位作用。VirD2、VirE2以及VirF蛋白進入植物細胞。（5）T－DNA拷貝與植物基因組的整合。 T－鏈蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細胞后，通過核膜上的小孔進入細胞核，與核DNA整合。整合機制尚不清楚。,,Agrobacteria attach to plant cell surfaces at wound sites. The plant releases wound signal compound

27、s, such as acetosyringone. The signal binds to virA on the Agrobacterium membrane. VirA with signal bound activates virG. Activated virG turns on other vir genes, including vir D and E. vir D cuts at a specific site

28、in the Ti plasmid (tumor-inducing), the left border. The left border and a similar sequence, the right border, delineate the T-DNA, the DNA that will be transferred from the bacterium to the plant cell Single stranded T

29、-DNA is bound by vir E product as the DNA unwinds from the vir D cut site. Binding and unwinding stop at the right border. The T-DNA is transferred to the plant cell, where it integrates in nuclear DNA. T-DNA codes for

30、 proteins that produce hormones and opines. Hormones encourage growth of the transformed plant tissue. Opines feed bacteria a carbon and nitrogen source.,農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)： 組成重組質(zhì)粒，含有邊界序列，能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中穿梭；含有完整的Vir基因。（1）共整合載體系

31、統(tǒng)：Ti質(zhì)粒上編碼致瘤基因的序列被一段pBR322DNA所取代，帶有外源基因的pBR322衍生中間載體由大腸桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，發(fā)生同源重組，外源基因整合到Ti質(zhì)粒上。（2）二元載體系統(tǒng)：一個農(nóng)桿菌株系中含有兩個彼此分離的質(zhì)粒，一個含有T－DNA和外源重組基因的多功能克隆載體質(zhì)粒。既能在農(nóng)桿菌中復(fù)制，并能夠從大腸桿菌遷移到農(nóng)桿菌，另一個質(zhì)粒含有Vir基因的Ti衍生質(zhì)粒。,如何將以上構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌？1. 直接用純化的小Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

32、含有vir區(qū)質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞；2. 采用三親雜交的方法。把三種有關(guān)菌株混合培養(yǎng)在一起進行的雜交稱為三親雜交。,（2）Ri質(zhì)粒： 一種能夠誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根的土壤桿菌（Agrobacterium rhizogenes），具有Ri質(zhì)粒，能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入植物細胞中。 其T－DNA包括TL－DNA和TR－DNA和中間大約15Kb的核心DNA，在TR－DNA上具有兩個非常重要的基因，tms1和tms2，指導(dǎo)IAA合

33、成，TR－DNA上還有編碼農(nóng)桿堿合成和甘露堿合成的基因。,2、病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：,病毒侵染細胞后把DNA導(dǎo)入寄主細胞，這些病毒能在寄主細胞借助寄主的遺傳系統(tǒng)進行復(fù)制和表達，該過程與農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒類似，也是一種潛在的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。 病毒作為基因轉(zhuǎn)化載體，已應(yīng)用與微生物和動物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，然而在植物基因轉(zhuǎn)移研究中仍處于初級階段。主要原因是大多數(shù)植物病毒是以RNA為遺傳物質(zhì)，對于RNA操作并沒有DNA不成熟。因此載體構(gòu)建較困難。

34、此外，未發(fā)現(xiàn)像動物細胞反轉(zhuǎn)錄病毒那樣能夠整合到宿主基因組中的植物病毒。因此，外源基因只能以游離拷貝的形式存在與細胞中，不能整合到植物染色體上進行穩(wěn)定遺傳和表達。 20世紀80年代，花椰菜花葉病毒(CaMV) 雙鏈DNA基因組及其后RNA和單鏈DNA病毒基因組被用來構(gòu)建植物基因工程載體。,植物病毒載體系統(tǒng)（1）單鏈RNA植物病毒載體系統(tǒng) 單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA克隆到質(zhì)粒上，把外源基因插入病毒的cDNA，通過體外轉(zhuǎn)錄，帶

35、有外源基因的病毒DNA感染進入植物宿主細胞。（2）單鏈DNA植物表達載體系統(tǒng) 由單鏈DNA分子組成，存在成對的病毒顆粒，即雙生病毒，可以把外源基因插入其中一種DNA。（3）雙鏈DNA植物病毒載體系統(tǒng) 將病毒基因組中非必需的核苷酸序列去掉，換上一段外源DNA而不影響病毒基因組的包裝，用這種病毒載體感染植物細胞實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。如花椰菜花葉病毒（CaMV），番茄金花葉病毒（TGMV）。,病毒表達載體構(gòu)建策略,植物病毒表達載體：（1

36、）置換型載體：外源基因置換植物病毒基因組復(fù)制影響不大的基因（2）插入型載體：外源基因插入病毒基因組不重要的編碼區(qū)（3）互補型載體：外源基因插入缺陷性病毒或置換某個基因。（4）表位展示型載體：通過在外殼蛋白基因中選擇性地插入外源基因，在不影響病毒組裝，侵染和復(fù)制的前提下，使其在病毒顆粒表面呈現(xiàn)，成為抗原決定簇（外源蛋白）植物病毒表達載體應(yīng)用存在的問題：（1）外源基因在轉(zhuǎn)化植物中的穩(wěn)定性差：不能整合（2）病毒的致病性；誘發(fā)病毒病

37、癥狀（3）植物病毒載體攜帶的外源基因和病毒載體本身的不穩(wěn)定。外源基因易丟失，病毒基因組易突變。,（三）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化基本程序： 1.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、純化保存及工程菌液的制備；28℃培養(yǎng)至對數(shù)期 2. 外植體的選擇；幼嫩葉片、子葉、下胚軸等 3. 外植體預(yù)培養(yǎng)、接種； 4. 農(nóng)桿菌侵染；OD600為0.5-0.7 5. 農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)； 共培養(yǎng)時間在16h以上，1-3d，農(nóng)桿菌增殖適度，加入AS等酚類物質(zhì)。

38、 6. 外植體脫菌及選擇培養(yǎng)。 通過抗生素殺死或抑制農(nóng)桿菌后進行抗生素選擇。,葉圓片法： 利用打孔器取得葉圓片或用刀切割葉片小塊，造成傷口，然后在傷口處侵入農(nóng)桿菌，去除多余菌液，置于適合的培養(yǎng)基表面培養(yǎng)一段時間（2-3d），再轉(zhuǎn)移至含有抗生素的選擇培養(yǎng)基上進行選擇并殺菌，轉(zhuǎn)化的細胞逐漸形成愈傷組織，再分化出不定芽，進一步形成完整轉(zhuǎn)化植株。（1）植物材料與農(nóng)桿菌的培養(yǎng)；（2）共培養(yǎng)；（3）篩選轉(zhuǎn)化植株；抗生素篩選（

39、4）轉(zhuǎn)化植株的分子雜交鑒定；PCR擴增，South雜交，North雜交，Western雜交，酶活性分析等。（5）性狀鑒定：抗逆性，生長發(fā)育特征整株感染 活體接種或受傷部位侵染，然后切下培養(yǎng)和篩選。原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng) 處于再生壁階段的原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)36-48h，離心洗滌后培養(yǎng)在含抗生素的培養(yǎng)基上篩選。,,番茄遺傳轉(zhuǎn)化操作過程,番茄遺傳轉(zhuǎn)化操作過程,四、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定分子檢測（1）Southern雜交，PCR

40、檢測：在DNA水平進行檢測（2）Northern雜交與RT-PCR檢測：RNA水平進行檢測， 還可以通過實時熒光定量PCR（real time quantitative fluorescent PCR）進行檢測。（3）Western雜交：蛋白質(zhì)水平進行檢測。通過抗原抗體的特異反應(yīng)檢測基因表達產(chǎn)物。（4）生物芯片技術(shù)檢測：將不同被檢樣品的mRNA分別用不同熒光物質(zhì)標記，各種探針等量混合與同一陣列雜交，分析雜交信號，

41、即可明確外源基因表達強弱差異。,2. 轉(zhuǎn)基因植株的目的性狀檢測 （1）生理生化指標檢測轉(zhuǎn)基因植株的目標性狀； 抗逆相關(guān)基因轉(zhuǎn)移可以檢測抗氧化酶等活性。 （2）生物學(xué)鑒定法：通過表型進行鑒定，如形態(tài)特征及抗逆表現(xiàn)等。3. 轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性分析 外源基因在當(dāng)代可以檢測到，還需要再下一代，甚至幾代能夠檢測到，才具有遺傳穩(wěn)定性。通常轉(zhuǎn)化二代中具有有1/4比例的純合體。,五、外源基因轉(zhuǎn)化在基因表達調(diào)控中的應(yīng)用 1、植

42、物基因啟動子研究 啟動子對基因表達十分關(guān)鍵，是決定性的，不同的基因均需要在5'上游區(qū)具有相應(yīng)的啟動子才能表達。 啟動子分為3類：（1）組成型啟動子：這類啟動子調(diào)控的下游基因始終維持在一定水平。（2）組織特異性或器官特異性啟動子：調(diào)控下游基因在特定的組織、器官或特殊發(fā)育階段表達。（3）誘導(dǎo)性啟動子：受環(huán)境條件刺激，而促進下游基因的表達。光誘導(dǎo)啟動子，熱激蛋白啟動子等。,為分析啟動子序列或基因表達而進行的基因構(gòu)建,2、

43、目的基因的瞬間表達（transient expression）和穩(wěn)定表達（stable expression） 瞬間表達是指導(dǎo)入外源基因后在短時間內(nèi)就能檢測到表達產(chǎn)物，但幾天后表達水平逐漸減低，直至消失的外源基因表達方式。主要是由于外源基因未整合到染色體上，而以游離轉(zhuǎn)存在?？梢杂糜谘芯繂幼?、增強子等在基因表達中的功能等。 穩(wěn)定表達是指轉(zhuǎn)基因植物能夠穩(wěn)定表達外源基因活性并能傳遞給后代。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化容易獲得穩(wěn)定表達的

44、轉(zhuǎn)化植株。,3、反義RNA及其在基因表達調(diào)控中的作用； 在轉(zhuǎn)基因研究中，除了試圖獲得外源基因表達外，有時轉(zhuǎn)化外源基因的目的是阻遏轉(zhuǎn)基因植物中特殊基因的表達，通過逆向遺傳學(xué)途徑確定基因的功能。 通過基因?qū)?，去除一些產(chǎn)生毒物的基因，一些蛋白質(zhì)及控制生長發(fā)育等。 使單個基因失活可以采用不同方法，如將外源基因插入其轉(zhuǎn)錄序列或啟動子序列，類似于轉(zhuǎn)座子插入失活一樣。原核生物中存在一種天然的RNA，能夠和mRNA互補，抑制mRNA