小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中癌干細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移亞群的研究.pdf

1、研究目的：
　　1、闡明小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中uPAR+細(xì)胞的干細(xì)胞特性。
　　2、證明uPAR+細(xì)胞群進(jìn)一步可分為uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-亞群，其中uPAR+CXCR4+亞群細(xì)胞是轉(zhuǎn)移性腫瘤干細(xì)胞。
　　研究方法：
　　1、首先用流式細(xì)胞分選術(shù)從小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中分選出uPAR+和uPAR-細(xì)胞，然后通過(guò)①裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，②體外無(wú)血清成球?qū)嶒?yàn)，③細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，④Transwe

2、ll體外侵襲實(shí)驗(yàn)，比較上述兩組細(xì)胞的致瘤能力、自我更新能力、分化潛能和侵襲能力，從而證明uPAR+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。
　　2、進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)uPAR+細(xì)胞亞群中CXCR4的表達(dá)，通過(guò)uPAR-FITC和CXCR4-PE雙熒光抗體標(biāo)記的方法證實(shí)存在uPAR+CXCR4+細(xì)胞亞群，并分選出uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-細(xì)胞。通過(guò)①Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，比較上述兩組細(xì)胞體外遷移能力，②裸鼠皮下接種上述兩組

3、細(xì)胞，構(gòu)建小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型，比較這兩組細(xì)胞的體內(nèi)遷移能力，從而證明uPAR+CXCR4+亞群細(xì)胞是轉(zhuǎn)移性腫瘤干細(xì)胞。
　　3、通過(guò)免疫組織化學(xué)法，觀測(cè)人小細(xì)胞肺癌組織中uPAR和CXCR4的表達(dá)和分布，并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、uPAR+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性
　　(1)uPAR+細(xì)胞具有高致瘤能力。流式細(xì)胞術(shù)分選出uPAR+和uPAR-細(xì)胞，在裸鼠皮下分別接種103個(gè)不同亞群細(xì)胞。一周后，接

4、種uPAR+細(xì)胞組小鼠皮下形成直徑約3mm的移植瘤，而接種uPAR-細(xì)胞的小鼠未見(jiàn)瘤形成。將uPAR+細(xì)胞形成的原代移植瘤分割成2mm3小塊繼續(xù)接種于裸鼠皮下，形成第二代移植瘤，以此進(jìn)行連續(xù)傳代。在連續(xù)傳代過(guò)程中，uPAR+細(xì)胞保持了致瘤的穩(wěn)定性，至今已在體外連續(xù)傳代12次，且uPAR+細(xì)胞在移植瘤中的表達(dá)率基本保持不變。三代以后瘤形成時(shí)間縮短，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯加快。
　　(2)uPAR+細(xì)胞具有自我更新能力。將分選的uPAR+和

5、uPAR-細(xì)胞分別按1×103/mL密度用無(wú)血清培養(yǎng)基接種于六孔板內(nèi)。培養(yǎng)三天后觀察到uPAR+細(xì)胞有所含細(xì)胞數(shù)約為10個(gè)左右的腫瘤細(xì)胞球形成，呈懸浮生長(zhǎng)；7天后每個(gè)球體所含細(xì)胞數(shù)有幾十個(gè)甚至上百個(gè)。而uPAR-細(xì)胞三天時(shí)未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞球形成，7天時(shí)細(xì)胞均已死亡。
　　(3)uPAR+細(xì)胞具有分化能力。將分選的uPAR+和uPAR-細(xì)胞置于含有10％血清的分化培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)三天后對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示：分選的uPAR+

6、細(xì)胞高表達(dá)uPAR，不表達(dá)Cytokeratin和CD56，培養(yǎng)三天后失表達(dá)uPAR，高表達(dá)Cytokeratin和CD56；uPAR-細(xì)胞標(biāo)志物未見(jiàn)明顯改變，始終不表達(dá)uPAR，高表達(dá)Cytokeratin和CD56。進(jìn)一步，將兩組細(xì)胞分別放入含有VEGF因子存在的三維培養(yǎng)基中，經(jīng)一周培養(yǎng)，uPAR+細(xì)胞分化形成管腔樣結(jié)構(gòu)，免疫熒光染色uPAR表達(dá)下降，可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的表達(dá)；接種uPAR+細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中可見(jiàn)少量

7、腫瘤細(xì)胞有血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Ⅷ相關(guān)抗原表達(dá)。而uPAR-細(xì)胞在上述實(shí)驗(yàn)中既無(wú)管腔樣結(jié)構(gòu)形成也不表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)志物。
　　(4)uPAR+細(xì)胞具有高侵襲性。通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，uPAR+細(xì)胞穿過(guò)基底膜的數(shù)量大于uPAR-細(xì)胞(P<0.05)，提示uPAR+細(xì)胞侵襲能力大于uPAR-細(xì)胞。進(jìn)一步，免疫熒光染色顯示：uPAR+細(xì)胞不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin，高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Fibronectin和V

8、imentin。表明其侵襲機(jī)制可能和細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。
　　2、轉(zhuǎn)移性腫瘤干細(xì)胞uPAR+CXCR4+亞群的分離鑒定
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CXCR4在uPAR+細(xì)胞中的表達(dá)：用uPAR-FITC和CXCR4-PE雙熒光抗體標(biāo)記H446細(xì)胞，流式分析結(jié)果顯示：H446細(xì)胞中存在uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-細(xì)胞亞群，其含量分別為1.3%和7.1%，證實(shí)uPAR+細(xì)胞可進(jìn)一步分為uPAR+CXCR4+和uPAR+

9、CXCR4-細(xì)胞亞群。
　　(1)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)比較uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示：在SDF-1趨化下，uPAR+CXCR4+組細(xì)胞穿過(guò)基底膜數(shù)明顯多于uPAR+CXCR4-組細(xì)胞(P<0.05)。兩組細(xì)胞加入AMD3100預(yù)處理后，在SDF-1趨化下穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)。提示uPAR+CXCR4+細(xì)胞亞群具有很高的遷移能

10、力，其遷移能力與CXCR4的作用密切相關(guān)。
　　(2)體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果：裸鼠皮下分別接種103個(gè)uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-細(xì)胞，一周后均有移植瘤形成，兩組細(xì)胞的移植瘤大小和生長(zhǎng)速度均無(wú)顯著差異。但8周后處死小鼠，解剖和鏡下檢查觀察到接種uPAR+CXCR4+細(xì)胞組的小鼠皮下移植瘤向肌層浸潤(rùn)，并可見(jiàn)肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，而接種uPAR+CXCR4-細(xì)胞的小鼠未見(jiàn)任何器官轉(zhuǎn)移。
　　3、uPAR和CXCR4在人小細(xì)胞肺癌

11、組織的表達(dá)及意義
　　50例人體小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中有17例呈uPAR陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)極少且表達(dá)多分布于癌巢周邊。uPAR陽(yáng)性表達(dá)組病人腫瘤大小明顯大于uPAR陰性組(P<0.05)，且uPAR陽(yáng)性表達(dá)組患者生存時(shí)間短于uPAR陰性組(P<0.05)。全部50例標(biāo)本中CXCR4均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，CXCR4的表達(dá)與臨床參數(shù)無(wú)必然聯(lián)系。
　　結(jié)論：
　　1、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中，uPAR+細(xì)胞具有高致瘤性和自我更新

12、能力。
　　2、uPAR+細(xì)胞具有向上皮細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分化的能力，并可能具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。
　　3、uPAR+細(xì)胞具有高侵襲性，其高侵襲能力可能與細(xì)胞發(fā)生了EMT有關(guān)。
　　4、uPAR+細(xì)胞群進(jìn)一步可分為uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-亞群。
　　5、uPAR+CXCR4+細(xì)胞在體外Transwell實(shí)驗(yàn)中顯示遷移能力強(qiáng)于uPAR+CXCR4-細(xì)胞，提示其具有較強(qiáng)的遷移能力。