小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中癌干細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移亞群的研究.pdf

1、研究目的：
　　1、闡明小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中uPAR+細(xì)胞的干細(xì)胞特性。
　　2、證明uPAR+細(xì)胞群進一步可分為uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-亞群，其中uPAR+CXCR4+亞群細(xì)胞是轉(zhuǎn)移性腫瘤干細(xì)胞。
　　研究方法：
　　1、首先用流式細(xì)胞分選術(shù)從小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中分選出uPAR+和uPAR-細(xì)胞，然后通過①裸鼠體內(nèi)成瘤實驗，②體外無血清成球?qū)嶒?，③?xì)胞分化實驗，④Transwe

2、ll體外侵襲實驗，比較上述兩組細(xì)胞的致瘤能力、自我更新能力、分化潛能和侵襲能力，從而證明uPAR+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。
　　2、進一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測uPAR+細(xì)胞亞群中CXCR4的表達，通過uPAR-FITC和CXCR4-PE雙熒光抗體標(biāo)記的方法證實存在uPAR+CXCR4+細(xì)胞亞群，并分選出uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-細(xì)胞。通過①Transwell遷移實驗，比較上述兩組細(xì)胞體外遷移能力，②裸鼠皮下接種上述兩組

3、細(xì)胞，構(gòu)建小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型，比較這兩組細(xì)胞的體內(nèi)遷移能力，從而證明uPAR+CXCR4+亞群細(xì)胞是轉(zhuǎn)移性腫瘤干細(xì)胞。
　　3、通過免疫組織化學(xué)法，觀測人小細(xì)胞肺癌組織中uPAR和CXCR4的表達和分布，并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、uPAR+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性
　　(1)uPAR+細(xì)胞具有高致瘤能力。流式細(xì)胞術(shù)分選出uPAR+和uPAR-細(xì)胞，在裸鼠皮下分別接種103個不同亞群細(xì)胞。一周后，接

4、種uPAR+細(xì)胞組小鼠皮下形成直徑約3mm的移植瘤，而接種uPAR-細(xì)胞的小鼠未見瘤形成。將uPAR+細(xì)胞形成的原代移植瘤分割成2mm3小塊繼續(xù)接種于裸鼠皮下，形成第二代移植瘤，以此進行連續(xù)傳代。在連續(xù)傳代過程中，uPAR+細(xì)胞保持了致瘤的穩(wěn)定性，至今已在體外連續(xù)傳代12次，且uPAR+細(xì)胞在移植瘤中的表達率基本保持不變。三代以后瘤形成時間縮短，腫瘤生長速度明顯加快。
　　(2)uPAR+細(xì)胞具有自我更新能力。將分選的uPAR+和

5、uPAR-細(xì)胞分別按1×103/mL密度用無血清培養(yǎng)基接種于六孔板內(nèi)。培養(yǎng)三天后觀察到uPAR+細(xì)胞有所含細(xì)胞數(shù)約為10個左右的腫瘤細(xì)胞球形成，呈懸浮生長；7天后每個球體所含細(xì)胞數(shù)有幾十個甚至上百個。而uPAR-細(xì)胞三天時未見腫瘤細(xì)胞球形成，7天時細(xì)胞均已死亡。
　　(3)uPAR+細(xì)胞具有分化能力。將分選的uPAR+和uPAR-細(xì)胞置于含有10％血清的分化培養(yǎng)基中，生長三天后對分化細(xì)胞進行免疫熒光檢測，結(jié)果顯示：分選的uPAR+

6、細(xì)胞高表達uPAR，不表達Cytokeratin和CD56，培養(yǎng)三天后失表達uPAR，高表達Cytokeratin和CD56；uPAR-細(xì)胞標(biāo)志物未見明顯改變，始終不表達uPAR，高表達Cytokeratin和CD56。進一步，將兩組細(xì)胞分別放入含有VEGF因子存在的三維培養(yǎng)基中，經(jīng)一周培養(yǎng)，uPAR+細(xì)胞分化形成管腔樣結(jié)構(gòu)，免疫熒光染色uPAR表達下降，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的表達；接種uPAR+細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中可見少量

7、腫瘤細(xì)胞有血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Ⅷ相關(guān)抗原表達。而uPAR-細(xì)胞在上述實驗中既無管腔樣結(jié)構(gòu)形成也不表達血管內(nèi)皮標(biāo)志物。
　　(4)uPAR+細(xì)胞具有高侵襲性。通過Transwell侵襲實驗比較發(fā)現(xiàn)，uPAR+細(xì)胞穿過基底膜的數(shù)量大于uPAR-細(xì)胞(P<0.05)，提示uPAR+細(xì)胞侵襲能力大于uPAR-細(xì)胞。進一步，免疫熒光染色顯示：uPAR+細(xì)胞不表達上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin，高表達間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Fibronectin和V

8、imentin。表明其侵襲機制可能和細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。
　　2、轉(zhuǎn)移性腫瘤干細(xì)胞uPAR+CXCR4+亞群的分離鑒定
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測CXCR4在uPAR+細(xì)胞中的表達：用uPAR-FITC和CXCR4-PE雙熒光抗體標(biāo)記H446細(xì)胞，流式分析結(jié)果顯示：H446細(xì)胞中存在uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-細(xì)胞亞群，其含量分別為1.3%和7.1%，證實uPAR+細(xì)胞可進一步分為uPAR+CXCR4+和uPAR+

9、CXCR4-細(xì)胞亞群。
　　(1)Transwell遷移實驗結(jié)果：通過Transwell遷移實驗比較uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示：在SDF-1趨化下，uPAR+CXCR4+組細(xì)胞穿過基底膜數(shù)明顯多于uPAR+CXCR4-組細(xì)胞(P<0.05)。兩組細(xì)胞加入AMD3100預(yù)處理后，在SDF-1趨化下穿過基底膜細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P>0.05)。提示uPAR+CXCR4+細(xì)胞亞群具有很高的遷移能

10、力，其遷移能力與CXCR4的作用密切相關(guān)。
　　(2)體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果：裸鼠皮下分別接種103個uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-細(xì)胞，一周后均有移植瘤形成，兩組細(xì)胞的移植瘤大小和生長速度均無顯著差異。但8周后處死小鼠，解剖和鏡下檢查觀察到接種uPAR+CXCR4+細(xì)胞組的小鼠皮下移植瘤向肌層浸潤，并可見肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，而接種uPAR+CXCR4-細(xì)胞的小鼠未見任何器官轉(zhuǎn)移。
　　3、uPAR和CXCR4在人小細(xì)胞肺癌

11、組織的表達及意義
　　50例人體小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中有17例呈uPAR陽性表達，陽性細(xì)胞數(shù)極少且表達多分布于癌巢周邊。uPAR陽性表達組病人腫瘤大小明顯大于uPAR陰性組(P<0.05)，且uPAR陽性表達組患者生存時間短于uPAR陰性組(P<0.05)。全部50例標(biāo)本中CXCR4均呈強陽性表達，CXCR4的表達與臨床參數(shù)無必然聯(lián)系。
　　結(jié)論：
　　1、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中，uPAR+細(xì)胞具有高致瘤性和自我更新

12、能力。
　　2、uPAR+細(xì)胞具有向上皮細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分化的能力，并可能具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。
　　3、uPAR+細(xì)胞具有高侵襲性，其高侵襲能力可能與細(xì)胞發(fā)生了EMT有關(guān)。
　　4、uPAR+細(xì)胞群進一步可分為uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4-亞群。
　　5、uPAR+CXCR4+細(xì)胞在體外Transwell實驗中顯示遷移能力強于uPAR+CXCR4-細(xì)胞，提示其具有較強的遷移能力。