鼻咽癌細胞系中腫瘤干細胞樣SP細胞的分離鑒定相關(guān)研究.pdf

1、研究背景與目的： 腫瘤組織的異質(zhì)性已經(jīng)得到了廣泛的認同。近來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在一群具有自我更新以及多向分化等一系列正常干細胞特征的細胞，這群細胞被命名為腫瘤干細胞(cancer stem cells or tumorstem cells，CSCs or TSCs)。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞具有很強的致瘤性，對放療、化療不敏感，即使大多數(shù)腫瘤細胞被消滅，腫瘤干細胞依然能夠卷土重來，成為腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因之一。SP細胞(side

2、 population cell，SP cell，側(cè)群細胞)是進行骨髓造血干細胞分離時，利用DNA熒光染料Hoechst 33342和流式細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)的特殊細胞亞群，它們具有自我更新、多向分化能力等一系列干細胞的生物學特征。研究人員們已經(jīng)在人體多種正常組織和一些實體腫瘤中分離得到了SP細胞，初步闡明了SP細胞的一系列生物學特征。但是迄今為止仍未見到有關(guān)人類鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)中SP細胞分離鑒

3、定的報道。 人類鼻咽癌是來源于鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤，其病因涉及遺傳背景、病毒感染以及生活習慣和生存環(huán)境等多種因素。在西歐和北美的高加索人群中鼻咽癌的發(fā)生率很低，但在中國南方、東南亞和北非的部分國家卻很常見。由于鼻咽癌在中國廣東省的發(fā)病率位居世界首位，鼻咽癌也有“廣東瘤”之稱。隨著近年來鼻咽癌診斷和治療手段的發(fā)展，患者的5年生存率有了一定提高，但放、化療無效以及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移仍然是鼻咽癌患者死亡的主要原因。于是，有必要深入研究鼻

4、咽癌的生物學特性，了解該疾病的發(fā)生發(fā)展過程。其中腫瘤干細胞研究將有可能成為突破點，為開發(fā)特異有效的靶向性治療方法提供思路，造福于鼻咽癌患者。 研究方法： 將生長狀態(tài)良好的NPC細胞經(jīng)DNA熒光染料Hoechst33342染色后進行流式細胞儀無菌分選，分別收集熒光陽性的NSP細胞和熒光陰性的SP細胞觀察它們的生長速度、周期分布以及形態(tài)差別，并進一步觀察它們是否具有干細胞的多種特征，如自我更新、多向分化能力等。將分選后的細胞

5、立即接種到培養(yǎng)板，進行克隆形成實驗來反映兩個細胞亞群克隆形成能力是否存在差別；并對分選后常規(guī)培養(yǎng)一段時間的細胞再次進行Hoechst 33342染色分析SP細胞的比例，觀察它們的多向分化能力；提取細胞總RNA進行PF-PCR來檢測ABCG2分子RNA水平的表達，用ABCG2單克隆抗體標記后進行流式細胞檢測ABCG2蛋白在細胞表面的表達情況。一系列的體外試驗后我們進行NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實驗，觀察兩細胞亞群在體內(nèi)的致瘤能力，這也是

6、證明腫瘤干細胞能力所通用的重要指標之一。 經(jīng)過以上一系列方法驗證了細胞的干細胞特征之后，我們進行放療和化療敏感性試驗，觀察它們的反應(yīng)性差別，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，同時，我們探索了可能的相關(guān)機制。此外，我們采用免疫熒光染色方法來分析細胞表面角蛋白分子的表達，希望為進一步從SP細胞亞群中分離鑒定腫瘤干細胞提供有效的標記分子。 最后，鑒于目前關(guān)于腫瘤干細胞的來源問題仍然沒有統(tǒng)一的認識，我們擬采用理化因素誘導(dǎo)的方法來觀察分化成

7、熟的終末腫瘤細胞是否可以出現(xiàn)腫瘤干細胞的表型。經(jīng)過有限稀釋接種細胞得到單個細胞克隆并擴大培養(yǎng)后，我們對單細胞克隆進行理化因素誘導(dǎo)，觀察處理后的細胞是否可以產(chǎn)生干細胞樣表型。首先，我們選用人類鼻咽癌細胞系CNE-2，對來自于該細胞系的NSP表型單細胞克隆進行誘導(dǎo)然后觀察SP細胞的比例。此外我們還對人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-CH細胞來源的CD133-單克隆細胞進行誘導(dǎo)，觀察干細胞標記物CD133+表達細胞比例的變化。 結(jié)果：

8、 我們發(fā)現(xiàn)NPC細胞系CNE-1、CNE-2、C666-1、SUNE-1和HONE-1中均有不同比例SP細胞(0.1﹪～6.8﹪)的存在。針對來源于CNE-2細胞系的SP細胞我們進行了系列研究，發(fā)現(xiàn)這些SP細胞具有正常干細胞的一些關(guān)鍵特征。這些SP細胞能夠無限增殖，在相同的培養(yǎng)環(huán)境中比NSP細胞生長迅速(P<0.001)。與NSP細胞相比，SP細胞還具有較高的克隆形成能力(P<0.001)，能夠分化產(chǎn)生NSP細胞并維持自身SP細胞的

9、比例在一個較穩(wěn)定的水平。從NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實驗我們發(fā)現(xiàn)，SP細胞具有很強的致瘤能力，10，000個SP細胞就可以形成腫瘤而NSP細胞需要至少200，000細胞才能形成腫瘤，腫瘤形成能力比。NSP細胞高出至少20倍。 SP細胞對化療藥物鹽酸米托葸醌、順鉑、絲裂霉素C等都有不同程度的耐受(P<0.001，P<0.05，P<0.05)，研究發(fā)現(xiàn)這種廣譜的耐藥現(xiàn)象與ABCG2分子的表達相關(guān)。與NSP細胞相比，SP細胞對放療不

10、敏感(P<0.05)，但是這種耐受狀態(tài)可以通過藥物Cyclopamine的預(yù)處理而得到改善。經(jīng)過對干細胞相關(guān)信號傳導(dǎo)通路Sonic Hedgehog(SHH)中重要成員Smo蛋白進行Western Blot分析，我們推測SP細胞的放療耐受現(xiàn)象與Smo蛋白的表達有關(guān)。 通過免疫熒光染色實驗我們發(fā)現(xiàn)角蛋白分子8和18在SP和NSP細胞上的表達水平相似。角蛋白分子19在SP和NSP細胞中的表達顯著低于角蛋白8和18，但是在SP細胞上的

11、表達依然高于NSP細胞(P<0.05)，說明該分子的表達在SP和NSP細胞之間存在一定的差異，可能在進一步分離鑒定鼻咽癌腫瘤干細胞的研究中有一定價值。 克隆誘導(dǎo)實驗中，無論是從人鼻咽癌細胞系CNE-2分選得到的NSP細胞或者是篩選出來的NSP單細胞克隆，在經(jīng)過紫外線以及絲裂霉素C的處理后都不同程度的出現(xiàn)了一小群SP細胞。而來源于人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-CH的CD133-單細胞克隆經(jīng)過同樣處理后(處理時間和劑量有所調(diào)整)，也

12、出現(xiàn)了CD133+的亞群。這些數(shù)據(jù)表明物理化學因素的誘導(dǎo)將有利于腫瘤干細胞表型的發(fā)生和發(fā)展，為腫瘤干細胞的腫瘤細胞來源提供了重要依據(jù)。 結(jié)論： 多種鼻咽癌細胞系中存在著SP細胞亞群。經(jīng)過對來源于CNE-2細胞系的SP細胞進行細致研究發(fā)現(xiàn)該細胞系中SP細胞具有干細胞的特征，包括無限增殖和自我更新能力，高克隆形成能力，多向分化潛能以及在小鼠體內(nèi)的強致瘤能力等。ABCG2分子的表達是SP細胞具有對多種化療藥物耐受性的可能機制之