鼻咽癌中腫瘤干細(xì)胞—表面標(biāo)志物及分離鑒定的探索.pdf

1、關(guān)于鼻咽部干細(xì)胞的研究已有一些報(bào)告，Zhang等利用Brdu標(biāo)記LRCs證實(shí)鼻咽黏膜基底部有散在干細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)散在LRCs。BrdU標(biāo)記的鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)細(xì)胞株5-8F接種到裸鼠皮下，8周后也可發(fā)現(xiàn)散在LRCs：Wang等利用Hoechst33342在NPC細(xì)胞株CNE2中分離出類似干細(xì)胞的側(cè)群細(xì)胞，且認(rèn)為CK19是NPC干細(xì)胞標(biāo)志物。 CD133作為上皮和間葉正常及腫瘤干細(xì)胞的重要

2、標(biāo)志物，但其是否為NPC腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物尚不清楚。所以本研究首先采用免疫組化等技術(shù)檢測NPC組織和細(xì)胞株中包括CK19在內(nèi)的角蛋白系列和CD133以尋找鼻咽干細(xì)胞標(biāo)志物；利用Brdu體外標(biāo)記鼻咽癌干細(xì)胞5-8F，經(jīng)體外培養(yǎng)和裸鼠體內(nèi)接種，獲得LRCs細(xì)胞，比較LRCs和CD133的表達(dá)，從另一角度證明CD133可能是鼻咽癌干細(xì)胞標(biāo)志物。在此基礎(chǔ)上，利用免疫磁珠分選系統(tǒng)從鼻咽癌細(xì)胞株5-8F細(xì)胞中分選CD133+細(xì)胞，接著通過球囊形成、

3、平板克隆、光學(xué)顯微鏡、電鏡觀察等實(shí)驗(yàn)對所獲得的CD133+干細(xì)胞細(xì)胞特性進(jìn)行檢測；最后通過TPA和Brdu藥物作用，試圖尋找富集干細(xì)胞方法。 方法： 1.尋找鼻咽癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CK19等角蛋白和CD133在NPC組織和細(xì)胞株中檢測 免疫組化檢測58例NPCs、28例鼻咽粘膜慢性炎、NPC細(xì)胞株裸鼠移植瘤和鼻咽癌細(xì)胞株中CK19、CK18、CK8、CK14和CK5/6等角蛋白表達(dá)；39例帶有不典型增生

4、和正常粘膜上皮的鼻咽癌組織以及各類細(xì)胞株中檢測CD133表達(dá)。根據(jù)免疫組化結(jié)果判斷CK19等角蛋白和CD133作為鼻咽癌干細(xì)胞的可能性。 2.CD133+細(xì)胞分離與純度分析 1)免疫磁珠法分選CD133+細(xì)胞 2)分選后細(xì)胞純度分析： a.流式細(xì)胞儀分析分選后的CD133+細(xì)胞的純度； b.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測分選后的CD133+細(xì)胞的純度； c.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分選后的CD133+細(xì)胞

5、和CD133-細(xì)胞中CD133mRNA水平。 3.鼻咽癌細(xì)胞株5-8F中LRCs細(xì)胞檢測，并與CD133+細(xì)胞率進(jìn)行比較 a.5-8F細(xì)胞株體外LRCs實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞生長至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)基中加入Brdu(10ng/ml)，連續(xù)培養(yǎng)7天后，撤除Brdu，繼續(xù)培養(yǎng)14天。培養(yǎng)過程中，分別在第2天、第7天和第14天，在潔凈的蓋玻片上做細(xì)胞爬片，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色。光鏡下選取十個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

6、b.裸鼠體內(nèi)成瘤 5-8F細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，向培養(yǎng)基中加入Brdu(10ng/ml)，48小時(shí)后，以1×106個(gè)細(xì)胞分別注入2只裸鼠雙側(cè)腋下，觀察成瘤情況。8周后，取出瘤塊，固定、石蠟包埋并切片，免疫組化檢測Brdu，Brdu陽性細(xì)胞即為標(biāo)記滯留細(xì)胞(LRCs)。光鏡下選取十個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。 c.比較CD133和Brdu表達(dá)情況，從另一角度驗(yàn)證CD133可能為鼻咽癌干細(xì)胞標(biāo)志物。 4.CD133+細(xì)胞生物

7、學(xué)特性鑒定 1)Sphere形成實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)基配方：無血清培養(yǎng)基DMEMF12+EGF+B27；CD133+細(xì)胞、CD133-細(xì)胞和未分選5-8F細(xì)胞以1000/ml的密度進(jìn)行培養(yǎng)，適時(shí)觀察Sphere形成時(shí)間、數(shù)量和大小。 2)克隆形成實(shí)驗(yàn) 把三種細(xì)胞(即CD133+細(xì)胞、CD133-細(xì)胞和未分選5-8F細(xì)胞)分別200個(gè)于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，一種細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，當(dāng)見肉眼可見的克隆形成，終止培養(yǎng)，顯微鏡下計(jì)

8、數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 3)光學(xué)顯微鏡、掃描及透射電鏡觀察 4)TPA和Brdu對5-8F細(xì)胞中CD133、ABCG2mRNA水平、蛋白水平以及CD133+細(xì)胞數(shù)量和生物學(xué)行為的影響 結(jié)論及創(chuàng)新之處： 1.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鼻咽癌中CSCs的存在；通過免疫組化等方法，并和LRCs做比較，初步證明CD133+癌細(xì)胞可能是鼻咽癌干細(xì)胞；并對前人提出的CK19作為鼻咽癌干細(xì)胞標(biāo)志物提出疑問。

9、 2.免疫磁珠分選法是分離CD133+細(xì)胞的一個(gè)行之有效的方法。 3.Sphere實(shí)驗(yàn)和體外克隆實(shí)驗(yàn)顯示CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞生物學(xué)行為不同；在光學(xué)顯微鏡和電鏡下觀察，CD133+和CD133-細(xì)胞形態(tài)上有差別。 4.Brdu除作為標(biāo)記物的功能外，在mRNA水平促進(jìn)細(xì)胞中CD133、ABCG2的表達(dá)，同TPA作用相反，后者抑制CD133和ABCG2的表達(dá)。在細(xì)胞水平上，它促使CD133+細(xì)胞數(shù)量增多，侵襲行為