Caveolin-1對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446生長和侵襲作用的體外研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤是當(dāng)今世界上嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，肺癌發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤之首。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的多臟器功能衰竭是患者死亡的主要原因。目前，臨床上防止腫瘤轉(zhuǎn)移是治療腫瘤的關(guān)鍵之一。隨著對(duì)腫瘤分子生物學(xué)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜而主動(dòng)的生物學(xué)過程，它包括癌細(xì)胞在原發(fā)灶增殖、脫落、侵入轉(zhuǎn)移點(diǎn)并增殖，在這個(gè)過程中存在著癌基因的激活和抑癌基因的失活等一系列遺傳學(xué)的改變。 Caveolae是細(xì)胞膜內(nèi)陷形

2、成的特殊膜結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Caveolin-1是Caveolae中的重要蛋白，與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子相互作用。上世紀(jì)90年代后期有研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1可以影響細(xì)胞的增殖、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化及血管的生長：是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，但是Caveolin-1與肺癌的相關(guān)研究較少，國內(nèi)外近乎沒有系列報(bào)道。本文旨在探討Caveolin-1基因?qū)θ诵〖?xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446生長和體外侵襲力的影響。 方法：we

3、stern blot檢測(cè)Caveolin-1在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H460、NCI-H446中的表達(dá)。用脂質(zhì)體法將已構(gòu)建的Caveolin-1真核表達(dá)載體導(dǎo)入到Caveolin-1基因缺失的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446中，經(jīng)G418篩選獲得可穩(wěn)定表達(dá)Caveolin-1的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H-446Cavl陽性克隆和對(duì)照陰性克隆H-446neo。western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定陽性克隆。用噻唑藍(lán)(MTT)法觀察

4、細(xì)胞增殖，結(jié)晶紫染色光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用Transwell小室法和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞體外侵襲、遷移能力的變化。用western blot和明膠酶譜方法檢測(cè)Caveolin-1蛋白表達(dá)對(duì)MMP-3表達(dá)及酶活性的影響，用western blot方法檢測(cè)Caveolin-1表達(dá)對(duì)E-cadherin表達(dá)的影響。結(jié)果：western blot檢測(cè)在人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446中Caveolin-1表達(dá)缺失。western blot和免疫

5、組織化學(xué)方法鑒定獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克?。宏栃钥寺-446Cavl和陰性克隆H-446neo。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染目的基因后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，轉(zhuǎn)染前NCI-H446細(xì)胞較小，偽足短，細(xì)胞呈克隆生長；轉(zhuǎn)染后H446-Cavl細(xì)胞體積增大，多突起，細(xì)胞生長較分散不呈克隆樣生長。生長曲線表明H446-Cavl細(xì)胞增殖水平明顯低于NCI-H446、H446neo細(xì)胞(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H446-Cavl

6、細(xì)胞穿透Matrigel膠細(xì)胞數(shù)較陰性克隆H-446neo明顯增多(P<0.05)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H446-Cavl遷移速度明顯高于NCI-H446、H446neo細(xì)胞(P<0.05)。用western blot檢測(cè)各細(xì)胞上清中MMP-3的表達(dá)，H446-Cavl與H446neo相比MMP-3表達(dá)明顯增高(P<0.05)。明膠酶譜方法檢測(cè)細(xì)胞上清中MMP-3活性，H446-Cavl上清中MMP-3活性明顯高于H446neo(P<0

7、.05)。用western blot檢測(cè)細(xì)胞中E-Cadherin的表達(dá)，H446-Cav1與H446neo、NCI-H446相比E-Cadherin表達(dá)明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論：1．人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446可以作為Caveolin-l基因體外研究的模型。2．Caveolin-l抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、增殖。3．Caveolin-l可以提高小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外侵襲和遷移能力。4．Caveolin．1可能通過下調(diào)E