加熱聯(lián)合紫杉醇對人小細胞肺癌NCI-H446細胞的影響.pdf

1、背景與目的；肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性疾病之一，其發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤之首。據統(tǒng)計，世界上每年約有135萬肺癌新發(fā)病例，且有118萬人死于該惡性疾病。盡管手術、化學治療(化療)、放射治療(放療)以及綜合治療手段在肺癌治療中有了長足的發(fā)展，但肺癌總的5年生存率仍然很低，如美國只有15％，歐洲平均為10％，中國及其他發(fā)展中國家更低，僅為8.9％。在各類肺癌中，小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是一種

2、較為特殊的類型，它發(fā)展快、侵襲性強、易發(fā)生早期遠隔轉移，惡性程度最高，預后極差。SCLC雖然對化療敏感，但很快即可產生多藥耐藥性；此外，由于化療藥物的毒副作用而被迫停藥導致化療失敗。2003年美國臨床腫瘤學會會議主席Dr．Bunn提出幾乎所有腫瘤均需多學科綜合治療。1985年熱療被美國食品與藥品管理局認證是繼手術、放療、化療和生物療法后的第5種腫瘤治療方法，已在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮了重要作用。 在熱化療聯(lián)合治療的實驗研究中,療效

3、會因為藥物的種類、加熱溫度和時間的不同而有明顯差異；紫杉醇系植物類抗癌藥，屬細胞毒類化合物，它可促使微管蛋白二聚體裝配成微管并阻止其解聚，從而抑制了腫瘤細胞的有絲分裂，造成細胞死亡。臨床應用發(fā)現紫杉醇治療實體瘤有較好的效果，與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合應用對肺癌有較好的治療效果。加熱能夠誘導細胞周期阻滯，增加化療藥物的細胞毒效應，同時增強細胞凋亡的誘導效應，可能是熱化療聯(lián)合的機制之一。加熱聯(lián)合紫杉醇治療腫瘤業(yè)已獲得較好的臨床效果。截至目前，對加

4、熱與紫杉醇聯(lián)合作用機制的研究還處于初級階段。在聯(lián)合作用上，尚需優(yōu)化加熱溫度、時間及其與紫杉醇濃度的搭配。本研究以人小細胞肺癌細胞株NCI-H446細胞作為研究對象，采用細胞與分子生物學技術相結合的手段，研究加熱與紫杉醇聯(lián)合對人小細胞肺癌增殖抑制率的影響及其可能的作用機制，以尋找熱化療聯(lián)合作用的最佳組合條件，為肺癌的綜合治療提供依據。 材料與方法 1 材料人小細胞肺癌細胞株NCT-H446細胞由中科院上海生命科學院營養(yǎng)所饋

5、贈，紫杉醇太極集團四川太極制藥有限公司生產(國藥準字H19994040)。 2 方法 2.1 實驗分組2.1.1 MTT法檢測NCI-H446細胞的增殖抑制率分組單純加熱組(39℃、40℃、41℃、42℃、43℃和44℃)；單純紫杉醇化療組(30μg/L、60 μg/L、120 μg/L、240μg/L和480 μg/L)；加熱聯(lián)合紫杉醇組(單純加熱組和單純紫杉醇組采用溫度、濃度組合的方法進行熱化療聯(lián)合)，每個處理組又分

6、為3個加熱時間段(30min、60min和90min)；對照組(0 μg/L、37℃)。 2.1.2 半定量RT-PCR檢測NCI-H446細胞中MMP-2和TNF-a表達量分組單純加熱組(43℃、90 min)：單純紫杉醇化療組(60 μg/L、120μg/L和240μg/L)；43℃加熱90min聯(lián)合紫杉醇組(60 μg/L、120 μg/L和240 μg/L)；對照組(0 μg/L、37℃)。 2.2 檢測方法和指

7、標在預實驗的基礎上，運用MTT法檢測加熱和紫杉醇單獨或聯(lián)合作用NCI-H446細胞后72h的增殖抑制率；以β-actin基因為內參照，運用半定量RT-PCR檢測單純43℃加熱90 min、單純紫杉醇化療(60 μg/L、120 μg/L和240 μg/L)以及43℃加熱90 min聯(lián)合紫杉醇(60 μg/L、120 μg/L和240 μg/L)處理NCI-H446細胞后72h的MMP-2和TNF-a的表達量。 2.3 統(tǒng)計學分析

8、應用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件，采用析因設計ANOVA、單因素ANOVA和SNK多重比較結果對數據進行統(tǒng)計分析；檢驗水準α=0.05。 結果 1不同濃度紫杉醇對NCI-H446細胞增殖抑制率整體組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=338.798，P=0.000)，結合多重比較結果，不同濃度紫杉醇組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，30μg/L與其它組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，60μg/L與

9、其它組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而120μg/L、240μg/L和480μg/L 3組組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由此得出紫杉醇在30 v～120 μg/L對細胞增殖抑制作用隨濃度的增高而增強，呈劑量.效應關系，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但120 μg/L以后化療藥對細胞增殖抑制呈水平狀態(tài)，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示紫杉醇達到一定濃度時增加濃度并不能增強抑制率，再結合增殖抑

10、制率評價標準(IR)，紫杉醇濃度為30 μg/L，表現為不敏感；60 μg/L，為低度敏感；120 μg/L～480 μg/L，為中度敏感，總體結果說明紫杉醇對NCI-H446細胞增殖抑制作用的最佳濃度是120μg/L，中度敏感。 2不同加熱溫度對NCI-H446細胞的增殖抑制率整體組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=12.670，P=0.000)；結合多重比較結果，39℃、40℃和42℃與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；

11、41℃、43℃和44℃組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；39℃與41℃、44℃組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而39℃與43℃組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；43℃其它各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示加熱對H446細胞增殖抑制作用的最佳溫度是43℃。 3不同加熱時間對NCI-H446細胞的增殖抑制率整體組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=242.569，P=0.000

12、)，結合多重比較結果，30 min、60 min、90 min組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在研究所選時間范圍內，90min最優(yōu)。 在加熱溫度和時間比較的基礎上結合基本統(tǒng)計量和IR評價標準，39℃～42℃各溫度在不同加熱時間下，以及43℃～44℃下加熱30 min和60 min下，都表現為不敏感；43℃和44℃在加熱90 min，表現為中度敏感，二者之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，選擇43℃加熱90

13、min。 4由析因設計ANOVA結果可知加熱溫度、加熱時間和紫杉醇三者對NCI-H446細胞增殖抑制率的影響，在所有組合中他們的交互效應表現為，紫杉醇與加熱溫度以及紫杉醇與加熱時間之間無交互作用(P>0.05)；而加熱溫度和加熱時間之間有交互作用(P<0.05)；三者之間有交互作用(P<0.05)；結合基本統(tǒng)計量和IR評價標準，加熱不同程度的提高了紫杉醇對NCI-H446細胞的增殖抑制率，敏感性提高了一個標準。對表現高度敏感的進

14、行統(tǒng)計分析，由析因設計原理，理論上紫杉醇濃度、加熱溫度和加熱時間三者的最佳組合條件是最大均值(0.917)的組合，即480 μg/L聯(lián)合43℃加熱90 min，但在相同溫度和相同時間作用下120 μg/L和480 μg/L組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，從臨床考慮選擇43℃加熱90 min聯(lián)合120 μg/L(均值為0.909)定為最優(yōu)組合條件。 5運用單因素ANOVA及多重比較的方法，對經過不同處理的NCI-H446細胞中M

15、MP-2表達量進行分析，得出紫杉醇化療組和對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；單純加熱組以及加熱聯(lián)合紫杉醇組和對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；單純紫杉醇化療組與之對應的加熱聯(lián)合紫杉醇組組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；加熱聯(lián)合紫杉醇組組間比較，除120μg/L聯(lián)合加熱和240μg/L聯(lián)合加熱(P>0.05)比較，差異無統(tǒng)計學意義外，其余之間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明43℃加熱90m

16、in聯(lián)合120μg/L對NCI-H446細胞中MMP-2的表達量影響最大，提示熱療可能是通過降低MMP-2的表達量而抑制細胞增殖。 6運用單因素方差分析及多重比較的方法，對經過不同處理的NCI-H446細胞中TNF-a表達量進行分析，得出60μg/L與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.238)外，其余都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；60μg/L與120μg/L比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余都有統(tǒng)計學意義(P<

17、0.05)；單純紫杉醇化療組與之對應的加熱聯(lián)合紫杉醇組組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；120μg/L聯(lián)合43℃加熱90min和240μg/L聯(lián)合43℃加熱90min比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.058)外；其余組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；說明43℃加熱90min聯(lián)合120μg/L對NCI-H446細胞中TNF-a的表達量影響最大，提示熱化療還可能通過提高TNF-a表達量，增強免疫力的基礎上抑制腫瘤細胞的增殖