地西他濱聯(lián)合紫杉醇對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系作用的相關(guān)研究.pdf

1、DNA甲基化是哺乳動物表觀遺傳修飾最為常見的方式,由于其直接參與調(diào)控體內(nèi)多種基因的表達(dá)和功能實(shí)現(xiàn),與細(xì)胞的分化和發(fā)育、基因印記和激活[1]、機(jī)體衰老等生命活動息息相關(guān),因此,一旦基因甲基化功能發(fā)生異常,即有可能誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生,尤其是發(fā)生于抑癌基因特定區(qū)域的高度甲基化將導(dǎo)致抑癌基因在轉(zhuǎn)錄時即發(fā)生失活,喪失抑制細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用[2,3]。
　　miR-200c是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的抑癌基因,現(xiàn)有

2、研究證實(shí)其在高分化腫瘤中的表達(dá)水平要高于分化較差、侵襲性較強(qiáng)的腫瘤[4],其作用機(jī)制可能與miR-200c表達(dá)缺失所介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)。發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞可通過多種方式在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移早期發(fā)揮重要作用,并顯著推進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展,并且同腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的療效不佳具有相關(guān)性。目前認(rèn)為,miR-200c基因啟動子區(qū)域發(fā)生高度甲基化是其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)失活的主要原因[5],其中TGF-β信號通路可能參與了該可

3、逆性的甲基化之中。miR-200c下游的重要靶點(diǎn)之一便是TUBB3,其3’UTR(3’untranslatedregion)區(qū)能夠與miR-200c核心序列相結(jié)合,并被miR-200c所指導(dǎo)的沉默復(fù)合體RISC降解。而TUBB3又是紫杉醇類抗微管藥物療效相關(guān)的重要靶標(biāo),其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)程度同紫杉醇類藥物的療效成負(fù)相關(guān)[6]。因此,我們對聯(lián)合運(yùn)用去甲基化藥物地西他濱與紫杉醇能否提高對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系增殖、凋亡的影響,以及該種聯(lián)用是否

4、通過上調(diào)miR-200c影響TUBB3的表達(dá)及EMT的功能狀況等進(jìn)行探討和研究。
　　本實(shí)驗(yàn)以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1975、H1299為研究對象,隨機(jī)分為四組,分別為對照組,地西他濱組、紫杉醇組、聯(lián)合組(地西他濱+紫杉醇處理)。首先采用MTT實(shí)驗(yàn)分別確定地西他濱與紫杉醇的工作濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)分別以各自的工作濃度進(jìn)行,H1299細(xì)胞系地西他濱工作濃度15.2umol/L,紫杉醇工作濃度為64.9nmol/L;H1975細(xì)胞系地西他濱工

5、作濃度18.7umol/L,紫杉醇工作濃度為11.2nmol/L。各組分別按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理后置于37℃、5％CO2條件下恒溫培養(yǎng),96h后均以MTT法測得地西他濱組、紫杉醇組及聯(lián)合組對H1299細(xì)胞的增殖抑制率(%)分別為:(32.97±2.76)、(55.23±2.20)、(82.51±2.18);H1975細(xì)胞的增殖抑制率則為(43.11±2.23)、(47.71±4.74)、(74.67±3.70)。聯(lián)合組同單純地西他濱及單純

6、紫杉醇應(yīng)用組比較,其增殖抑制率均差異顯著(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測H1299細(xì)胞各組的細(xì)胞凋亡率(%)分別為:(1.87±0.52)、(19.33±0.57)、(37.03±1.81)、(71.8±1.84);H1975細(xì)胞各組的細(xì)胞凋亡率分別為:(2.43±0.53)、(16.5±2.61)、(44.13±2.50)、(68.2±2.02)。地西他濱聯(lián)合紫杉醇組同地西他濱組及紫杉醇組比較亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)證明

7、,地西他濱與紫杉醇類藥物聯(lián)合運(yùn)用的協(xié)同抗非小細(xì)胞肺癌的作用更明顯。
　　此外,RealtimePCR檢測兩種細(xì)胞中miR-200c各組的表達(dá)情況,顯示在地西他濱組及聯(lián)合組中,miR-200c的表達(dá)水平提高,而在對照組與紫杉醇組中無顯著差異;Luminex液相芯片儀流式熒光法檢測TUBB3mRNA的變化趨勢,提示在地西他濱組及聯(lián)合組中,TUBB3mRNA的表達(dá)水平降低,對照組及紫杉醇組無顯著差異;Westernblot法檢測EMT標(biāo)

8、志物E-cadherin及Vimentin在H1975及H1299中表達(dá)情況,地西他濱及聯(lián)合組E-cadherin表達(dá)增高而Vimentin下調(diào),同無地西他濱應(yīng)用組比較存在差異。實(shí)驗(yàn)提示,該種聯(lián)合可能是通過上調(diào)miR-200c的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞TUBB3mRNA表達(dá)降低及逆轉(zhuǎn)EMT。
　　我們將H1975細(xì)胞作為研究對象,以不同濃度梯度的地西他濱處理,96h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,并分別檢測各組細(xì)胞中miR-

9、200c,TUBB3及E-cadherin的表達(dá)水平,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):對照組H1975細(xì)胞形態(tài)呈梭形,為較典型的類間質(zhì)細(xì)胞表型,生長狀況良好,數(shù)量較多;而施加不同濃度地西他濱干預(yù)的試驗(yàn)組則在濃度提高至20μmol/L時部分細(xì)胞出現(xiàn)梭形的改變,部分出現(xiàn)類似上皮細(xì)胞的表型,且細(xì)胞數(shù)量少于對照組;miR-200c與E-cadherin隨地西他濱的濃度的增高而表達(dá)水平提高;TUBB3mRNA和Vimentin則隨地西他濱的濃度增高表達(dá)水平降低。<

10、br>　　綜上所述,我們探討了地西他濱聯(lián)合紫杉醇在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中應(yīng)用對其增殖、凋亡的影響,通過研究證實(shí)了該種聯(lián)用具有協(xié)同作用。且該種聯(lián)用可能是通過上調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)的miR-200c的表達(dá)水平從而影響TUBB3mRNA的表達(dá),增強(qiáng)了紫杉醇類藥物對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用。地西他濱的這種上調(diào)miR-200c表達(dá)的作用間接誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞發(fā)生MET,且與其濃度水平相關(guān)。由于EMT現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)與對抗腫瘤藥物的療效相關(guān),故認(rèn)為該種藥物聯(lián)合可