葛根粗提物及葛根素對人小細胞肺癌H446細胞生長的作用及其機制.pdf

1、我國大別山部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)大量野葛植物生長，資源豐富，并被用于臨床，表現(xiàn)出多種藥理作用，但是，葛根抗腫瘤作用的研究國外文獻未見報道，國內(nèi)杜德極等人先后研究了葛根提取物對P388白血病、W256癌、EAC腹水瘤、S180肉癌、H22肝癌的體外抗腫瘤作用以及對EAC腹水瘤、S180肉瘤、Lewis肺癌、H22肝癌的體內(nèi)抗腫瘤作用，并且采用EAC腹水癌和P388白血病模型試驗對葛根提取物組分的體外抗癌活性進行了比較。然而，葛根粗提物(puerar

2、iacrudeextract，CP)和葛根素(standard ofpure puerarin,SP)對人小細胞肺癌H446細胞的作用及其機制研究，尤其以H446肺癌模型試驗觀察比較CP和SP體外抑瘤作用以及葛根粗提物組分群與藥效間的“譜效”研究國內(nèi)外均未見報道。 肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在我國許多城市已位居全部惡性腫瘤死因的首位。我國多數(shù)地區(qū)的肺癌發(fā)病率和死亡率在過去的20～30年間迅速增長，并將繼續(xù)保持這一增長趨勢，

3、成為嚴重危害我國人民身體健康的最主要疾病之在尋找既具有強大的腫瘤細胞殺傷效應(yīng)，又對正常細胞不產(chǎn)生明顯毒副作用的理想抗腫瘤藥物過程中，人們發(fā)現(xiàn)，植物藥全草及其活性成分是值得深入探索的方向之一。近年來，植物來源的抗腫瘤藥引起廣泛重視。 細胞增殖失控或細胞凋亡受阻都可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，同時，細胞周期調(diào)控異常也是細胞增殖失控導(dǎo)致癌變的重要原因。目前，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，調(diào)控細胞周期運行已成為治療癌癥的一種新思路，并為篩選安全有效的抗癌藥提供

4、了新的方向。因此，本課題擬在CP和SP作用H446細胞后，應(yīng)用顯微鏡觀察、凋亡形態(tài)學(xué)觀察、MTT法、流式細胞術(shù)和細胞免疫化學(xué)方法等對其細胞形態(tài)、細胞增殖、細胞凋亡和細胞周期等生物學(xué)行為，以及與細胞增殖、凋亡和細胞周期相關(guān)的蛋白進行研究，了解CP和SP對H446細胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)和細胞周期調(diào)控的作用，并進一步在蛋白水平闡明其作用機制，從而為CP和SP應(yīng)用于臨床治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)。 目的 1．探討葛根粗提物及其主要成

5、份葛根素對H446細胞增殖活力，凋亡率和細胞周期分布的影響，研究CP和SP抑制人小細胞肺癌細胞生長的作用，并對兩者的生物學(xué)效應(yīng)進行比較。 2．初步探討葛根粗提物及其主要成分葛根素抑制H446細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，改變其細胞周期分布的機制。 方法 1．采用MTT法測定不同濃度CP和SP分別作用24、48、72、96、120小時后，H446細胞生長抑制率。 2．利用凋亡細胞形態(tài)學(xué)檢測方法，觀察CP和SP引起的

6、H446細胞形態(tài)學(xué)改變。 3．通過流式細胞術(shù)分析CP和SP作用于H446細胞后，細胞凋亡率和細胞周期分布情況。 4．采用細胞免疫化學(xué)方法和流式細胞術(shù)檢測細胞增殖核抗原，細胞凋亡和細胞周期相關(guān)蛋白表達情況。 結(jié)果 1．CP和SP均可不同程度的抑制H446細胞的塵長，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系。 2.相同條件下，CP對：H446細胞生長的抑制作用比SP強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

7、 3.CP和SP作用于H446細胞后，細胞呈現(xiàn)典型凋亡細胞特征，且定量分析表明，細胞凋亡率分別為14.71％和2.61％，CP組凋亡率高于對照組凋亡率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 4.細胞周期分布表明：CP和SP作用于H446細胞后，G0/G1期細胞構(gòu)成比分別為79.20％和72.20％，G2/M期細胞構(gòu)成比分別為8.94％和10.50％，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 5.細胞周期動

8、力學(xué)顯示，CP和SP作用于H446細胞后，細胞增殖指數(shù)減少，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且CP組細胞增殖指數(shù)小于SP組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 6.CP作用于H446細胞后，PCNA蛋白表達量減少，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而SP作用于H446細胞后，PCNA蛋白表達量與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 7.CP和SP均可使H446細胞Bax蛋白表達

9、上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意(P<0.05)，且CP作用于H446細胞后，Bax/Bcl-2比值高于SP，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 8.CP和SP作用于H446細胞后，F(xiàn)as蛋白表達量均增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且CP使細胞Fas蛋白表達量高于SP，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 9.CP和SP作用于H446細胞后

10、， CDK<,2>蛋白表達量減少，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CP和SP使H446細胞cyclinD<,1>蛋白和CDK<,4>蛋白陰性表達，P27蛋白陽性表達，且CP使H446細胞cyclinD<,1>和CDK<,4>蛋白的熒光指數(shù)低于SP，P27蛋白的熒光指數(shù)高于SP，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 1.CP和SP均具有抑制H446細胞生長的作用，且在相同條件下，CP的抑制作用較S

11、P顯著。 2.CP可以誘導(dǎo)H446細胞凋亡，而SP無此作用。 3.CP和SP作用于H446細胞后均延長了G0/G1期，縮短了S期和G2/M期。 4.CP可能通過下調(diào)PCNA蛋白的表達而抑制H446細胞的增殖。 5.CP可能通過調(diào)節(jié)Bax和Bel-2蛋白的表達比例而促進H446細胞的凋亡。 6.CP可能通過上調(diào)Fas蛋白的表達而誘導(dǎo)H446細胞的凋亡。 7.CP和SP使H446細胞cyeli