葛根粗提物及葛根素對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及其機(jī)制.pdf

1、我國(guó)大別山部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)大量野葛植物生長(zhǎng)，資源豐富，并被用于臨床，表現(xiàn)出多種藥理作用，但是，葛根抗腫瘤作用的研究國(guó)外文獻(xiàn)未見報(bào)道，國(guó)內(nèi)杜德極等人先后研究了葛根提取物對(duì)P388白血病、W256癌、EAC腹水瘤、S180肉癌、H22肝癌的體外抗腫瘤作用以及對(duì)EAC腹水瘤、S180肉瘤、Lewis肺癌、H22肝癌的體內(nèi)抗腫瘤作用，并且采用EAC腹水癌和P388白血病模型試驗(yàn)對(duì)葛根提取物組分的體外抗癌活性進(jìn)行了比較。然而，葛根粗提物(puerar

2、iacrudeextract，CP)和葛根素(standard ofpure puerarin,SP)對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究，尤其以H446肺癌模型試驗(yàn)觀察比較CP和SP體外抑瘤作用以及葛根粗提物組分群與藥效間的“譜效”研究國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。 肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)許多城市已位居全部惡性腫瘤死因的首位。我國(guó)多數(shù)地區(qū)的肺癌發(fā)病率和死亡率在過(guò)去的20～30年間迅速增長(zhǎng)，并將繼續(xù)保持這一增長(zhǎng)趨勢(shì)，

3、成為嚴(yán)重危害我國(guó)人民身體健康的最主要疾病之在尋找既具有強(qiáng)大的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)，又對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生明顯毒副作用的理想抗腫瘤藥物過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)，植物藥全草及其活性成分是值得深入探索的方向之一。近年來(lái)，植物來(lái)源的抗腫瘤藥引起廣泛重視。 細(xì)胞增殖失控或細(xì)胞凋亡受阻都可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，同時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控異常也是細(xì)胞增殖失控導(dǎo)致癌變的重要原因。目前，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期運(yùn)行已成為治療癌癥的一種新思路，并為篩選安全有效的抗癌藥提供

4、了新的方向。因此，本課題擬在CP和SP作用H446細(xì)胞后，應(yīng)用顯微鏡觀察、凋亡形態(tài)學(xué)觀察、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫化學(xué)方法等對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等生物學(xué)行為，以及與細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白進(jìn)行研究，了解CP和SP對(duì)H446細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控的作用，并進(jìn)一步在蛋白水平闡明其作用機(jī)制，從而為CP和SP應(yīng)用于臨床治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)。 目的 1．探討葛根粗提物及其主要成

5、份葛根素對(duì)H446細(xì)胞增殖活力，凋亡率和細(xì)胞周期分布的影響，研究CP和SP抑制人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并對(duì)兩者的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行比較。 2．初步探討葛根粗提物及其主要成分葛根素抑制H446細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，改變其細(xì)胞周期分布的機(jī)制。 方法 1．采用MTT法測(cè)定不同濃度CP和SP分別作用24、48、72、96、120小時(shí)后，H446細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。 2．利用凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，觀察CP和SP引起的

6、H446細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 3．通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析CP和SP作用于H446細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布情況。 4．采用細(xì)胞免疫化學(xué)方法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖核抗原，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 1．CP和SP均可不同程度的抑制H446細(xì)胞的塵長(zhǎng)，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 2.相同條件下，CP對(duì)：H446細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用比SP強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

7、 3.CP和SP作用于H446細(xì)胞后，細(xì)胞呈現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞特征，且定量分析表明，細(xì)胞凋亡率分別為14.71％和2.61％，CP組凋亡率高于對(duì)照組凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4.細(xì)胞周期分布表明：CP和SP作用于H446細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞構(gòu)成比分別為79.20％和72.20％，G2/M期細(xì)胞構(gòu)成比分別為8.94％和10.50％，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5.細(xì)胞周期動(dòng)

8、力學(xué)顯示，CP和SP作用于H446細(xì)胞后，細(xì)胞增殖指數(shù)減少，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且CP組細(xì)胞增殖指數(shù)小于SP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 6.CP作用于H446細(xì)胞后，PCNA蛋白表達(dá)量減少，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而SP作用于H446細(xì)胞后，PCNA蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 7.CP和SP均可使H446細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)

9、上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)，且CP作用于H446細(xì)胞后，Bax/Bcl-2比值高于SP，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 8.CP和SP作用于H446細(xì)胞后，F(xiàn)as蛋白表達(dá)量均增加，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且CP使細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)量高于SP，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 9.CP和SP作用于H446細(xì)胞后

10、， CDK<,2>蛋白表達(dá)量減少，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CP和SP使H446細(xì)胞cyclinD<,1>蛋白和CDK<,4>蛋白陰性表達(dá)，P27蛋白陽(yáng)性表達(dá)，且CP使H446細(xì)胞cyclinD<,1>和CDK<,4>蛋白的熒光指數(shù)低于SP，P27蛋白的熒光指數(shù)高于SP，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 1.CP和SP均具有抑制H446細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且在相同條件下，CP的抑制作用較S

11、P顯著。 2.CP可以誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡，而SP無(wú)此作用。 3.CP和SP作用于H446細(xì)胞后均延長(zhǎng)了G0/G1期，縮短了S期和G2/M期。 4.CP可能通過(guò)下調(diào)PCNA蛋白的表達(dá)而抑制H446細(xì)胞的增殖。 5.CP可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bel-2蛋白的表達(dá)比例而促進(jìn)H446細(xì)胞的凋亡。 6.CP可能通過(guò)上調(diào)Fas蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)H446細(xì)胞的凋亡。 7.CP和SP使H446細(xì)胞cyeli