葛根總黃酮、葛根素、大豆甙元誘導(dǎo)K-562細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia/chronic granulocyticleukemia；CML/CGL)簡(jiǎn)稱慢粒，是一種獲得性多能造血干細(xì)胞的克隆增殖性疾病，Ph染色體t(9；22)(q34；q11)為其特征性遺傳學(xué)標(biāo)志。這一特異的染色體異常產(chǎn)生的BCR/ABL融合基因，轉(zhuǎn)錄翻譯生成分子量為210kDa的蛋白—P210BCR/ABL。該蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶(tyrosine kinase

2、，TK)活性，是CML形成的分子基礎(chǔ)。Bel-2基因、死亡受體及其配體Fas/FasL都是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的重要信號(hào)分子。
　　 血復(fù)康是江蘇省中醫(yī)院血液科于1989年根據(jù)中醫(yī)解毒活血法獨(dú)創(chuàng)的復(fù)方制劑，主要由青黛、莪術(shù)、葛根組成。近五年課題組對(duì)血復(fù)康治療慢粒在細(xì)胞和分子水平的作用機(jī)制方面進(jìn)行了較為深入的研究，證明了不同濃度、不同時(shí)段血復(fù)康處理K-562細(xì)胞(CML細(xì)胞株)后，BCR/ABL融合基因、JWA基因及抗凋亡基因Bcl

3、-2均呈濃度及時(shí)間依賴性下降；細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)典型的凋亡特征；對(duì)血復(fù)康各組分(青黛、葛根、莪術(shù))誘導(dǎo)K-562細(xì)胞凋亡的初步研究表明：三種單藥成分均能誘導(dǎo)K-562細(xì)胞凋亡，而且其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑不盡相同。令人感興趣的是，不同濃度葛根總黃酮(0、2.5、5.0、7.5、10、20 mg/ml)處理K-562細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率和BCR/ABL融合蛋白均呈濃度依賴性下調(diào)；部分上調(diào)K-562細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)，觸發(fā)了我們進(jìn)一步研究其

4、可能分子機(jī)制的興趣。本課題試圖進(jìn)一步從mRNA和蛋白水平研究葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元誘導(dǎo)K-562細(xì)胞凋亡可能的分子機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.研究不同濃度葛根總黃酮(0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/ml)、葛根素(0、0.1、1.0、5.0、10 mmol/L)、大豆甙元(0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)處理K-562細(xì)胞后不同時(shí)段(0、24、48、72小時(shí))對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

5、；2.經(jīng)上述藥物處理K-562細(xì)胞后，各組BCR/ABL融合基因、Bcl-2基因在mRNA水平表達(dá)的變化；3.各組藥物處理前后P210BCR/ABL、Bel-2、Fas/FasL在蛋白水平表達(dá)的變化。分別探討不同濃度、不同時(shí)段葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響及可能的分子機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：以K-562細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)段葛根總黃酮及其成分葛根素

6、、大豆甙元對(duì)K-562細(xì)胞增殖的影響；Hoechst33258染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitatiVe reverse transcription polymerase chain reaction，SQ-RT-PCR)檢測(cè)各組藥物作用K-562細(xì)胞前后BCR/ABL融合基因、Bcl-2基因表達(dá)的變化；Western blot檢測(cè)P210、Bcl-2、Fas/FasL蛋白的變化。

7、　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元對(duì)K-562細(xì)胞增殖的影響：不同濃度、不同時(shí)段葛根總黃酮、葛根素、大豆甙元與細(xì)胞增殖抑制成正相關(guān)。2.葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元對(duì)K-562細(xì)胞凋亡的影響：①Hoechst染色結(jié)果：低濃度葛根總黃酮(1 mg/ml)、葛根素(1 mmol/L)、大豆甙元(0.5 mmol/L)處理K-562細(xì)胞48小時(shí)后，可檢測(cè)到明顯的細(xì)胞凋亡；②流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：不同濃度葛根總黃酮及其

8、成分葛根素、大豆甙元處理K-562細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率呈濃度-時(shí)間正相關(guān)。3.半定量RT-PCR結(jié)果：不同濃度葛根總黃酮、葛根素處理組BCR/ABL融合基因的表達(dá)呈濃度依賴性下降；而大豆甙元處理組無(wú)明顯變化；Bcl-2基因的表達(dá)在各處理組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.western blot結(jié)果：葛根總黃酮、葛根素處理組P210蛋白的表達(dá)呈濃度.時(shí)間依賴性下降；而大豆甙元處理組無(wú)明顯變化；Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)在各處理組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

9、葛根總黃酮處理組Fas、FasL蛋白的表達(dá)呈濃度.時(shí)間依賴性上升，而葛根素、大豆甙元處理組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：1.葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元均能抑制K-562細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈時(shí)間及濃度依賴性上調(diào)。2.不同濃度、不同時(shí)段葛根總黃酮、葛根素處理組在mRNA和蛋白水平均能部分抑制K-562細(xì)胞BCR/ABL的表達(dá)，說(shuō)明其誘導(dǎo)K-562細(xì)胞凋亡的作用可能是通過(guò)部分降低酪氨酸激酶活性而實(shí)現(xiàn)的；而大豆甙元處理組并