葛根總黃酮誘導NB4細胞凋亡與JNK相關信號分子.pdf

1、[背景與目的]
　　葛根總黃酮是中藥葛根的主要有效成分之一，近5年來，課題組研究發(fā)現(xiàn)葛根總黃酮(Puerariae radix flavones，PRF)在12.5～200μg/ml對不同急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)細胞株（HL-60、Kasumi-1、NB4和U937）有選擇性抑制作用，以NB4細胞最強，并影響上述細胞的細胞周期進程，阻滯細胞于S期，促進細胞凋亡。體內(nèi)實驗證明上述劑量PR

2、F可以延長NB4細胞異種移棺瘤裸鼠的生存周期，抑制移植瘤裸鼠的生存周期、抑制移植瘤瘤體的增長。課題組進一步選用更低濃度PRF（0～50μg/ml）干預NB4細胞，發(fā)現(xiàn)較低劑量PRF便能有效抑制NB4細胞株增殖，影響細胞周期進程，阻滯細胞于S期，促進細胞凋亡，同時證明PRF體外誘導NB4細胞凋亡時，JNK蛋白活化，caspase3和caspase8上調，p38MAPK表達下調。在此基礎上，本研究以NB4細胞為研究對象，通過JNK抑制劑sp

3、600125阻斷JNK信號分子，檢測0～50μg/mlPRF對NB4細胞凋亡的影響及JNK下游相關信號分子的變化，進一步驗證JNK信號通路在PRF誘導的NB4細胞凋亡中可能的作用或地位
　　[方法]
　　1、0、10、30、50μg/ml PRF作用于NB4細胞24、48及72小時，MTT法檢測NB4細胞的增殖抑制率
　　2、0、10、30、50μg/ml PRF作用于NB4細胞48小時，瑞氏染色觀察NB4細胞形態(tài)學變

4、化
　　3、0、10、30、50μg/ml PRF作用于NB4細胞48小時，F(xiàn)ITC-Annexin V/PI雙染法檢測細胞早期凋亡率改變
　　4、0、10、30、50μg/ml PRF±10μmol/L sp600125作用于NB4細胞48小時，流式細胞術檢測細胞周期進程、線粒體膜電位變化
　　5、0、10、30、50μg/ml PRF±10μmol/L sp600125作用于NB4細胞48小時，蛋白印記法檢測JNK

5、通路相關蛋白改變
　　[結果]
　　1、PRF對NB4細胞有增殖抑制作用
　　10、30、50μg/mlPRF能夠抑制NB4細胞增殖，呈濃度-時間依賴性。PRF干預NB4細胞24、48、72hIC50分別為28.81、17.17、8.33μg/ml。
　　2、細胞形態(tài)學改變
　　0～50μg/ml PRF干預NB4細胞48h，隨濃度增加，瑞氏染色示凋亡特征逐漸明顯。
　　3、細胞凋亡率改變
　　

6、0～50μg/ml PRF干預NB4細胞48h，流式細胞術提示早期凋亡率隨濃度升高而增加，10、30、50μg/ml PRF組早期凋亡率分別為6.2％、23.1％、37.1％，具有統(tǒng)計學差異。
　　4、細胞周期改變
　　0～50μg/ml PRF作用于NB4細胞48h后，細胞阻滯于S期，呈典型的凋亡改變。JNK抑制劑sp600125與PRF共同干預NB4細胞48h后，PRF雖仍可影響細胞周期進程，但S期細胞數(shù)較單藥組減少。<

7、br>　　5、線粒體膜電位改變
　　0～50μg/ml PRF作用NB4細胞48h，流式細胞術定性分析提示線粒體膜電位隨著濃度升高而降低;JNK特異性抑制劑sp600125與PRF共同干預NB4細胞48h后，較之各PRF單藥組，線粒體膜電位升高，較之SP600125單藥組，線粒體膜電位隨著PRF濃度升高而降低。
　　6、PRF影響NB4細胞凋亡相關蛋白表達的檢測
　　NB4細胞在PRF干預48小時后，隨著細胞凋亡的增加

8、，JNK、p-JNK、ERK、Fas、cleaved caspase-3表達上調，p38、Bcl-2、pro-caspase9、pro-caspase3表達下調，而p53在10μg/mlPRF組表達上調，30、50μg/ml組表達下調，cyto-c在10μg/mlPRF組表達下調，30、50μg/ml組表達上調，cleaved caspase-8在10μg/mlPRF組表達下調，30μg/ml組無明顯變化，在50μg/ml表達上調，JN

9、K抑制劑sp600125與PRF共同干預NB4細胞48小時后，較之單藥組JNK、p-JNK、ERK、p38、p53、Fas、cyto-c、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3表達受抑制，Bcl-2表達增加，而pro-caspase3、pro-caspase9在10μg/mlPRF組表達受抑制，30、50μg/ml組表達增加。本研究未檢測到p-p53表達。
　　[結論]
　　較低濃度PRF能有