亞硒酸鈉誘導人急性早幼粒白血病NB4細胞凋亡作用機制研究.pdf

1、本文針對亞硒酸鈉誘導人急性早幼粒白血病NB4.細胞線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導通路中Bcl-2家族成員的作用機制以及MAPK/Akt等上游蛋白激酶通路的作用機制進行了研究，并在研究中取得以下結(jié)果。 在20 μ M亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡過程中，伴隨有NB4細胞線粒體膜電位的降低，細胞色素C由線粒體向細胞質(zhì)的釋放，應(yīng)用caspase 9抑制劑z-LEHD-fmk可以有效抑制亞硒酸鈉誘導的NB4細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在NB4細胞凋亡過程

2、中，抗凋亡蛋白Bcl-xL含量下降，促凋亡蛋白Bax和Bak蛋白水平均顯著上調(diào)，而且Bax在凋亡晚期可以被切割產(chǎn)生18 kD的切割產(chǎn)物。提取細胞線粒體發(fā)現(xiàn)線粒體上的Bax，Bak含量隨凋亡的進行而增加，發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)位，DSS交聯(lián)實驗發(fā)現(xiàn)Bax發(fā)生了同源二聚化。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)NB4細胞中的Bax水平可以有效抑制凋亡的進行。Bad蛋白水平發(fā)生上調(diào)，而Bad的Ser 112和Ser 136的磷酸化修飾發(fā)生下調(diào)。Bid蛋白在凋亡晚期明

3、顯下調(diào)，但未發(fā)現(xiàn)明顯的切割反應(yīng)，caspase 8抑制劑z-IETD-fmk對亞硒酸鈉誘發(fā)的凋亡影響不顯著。同時還檢測了Bcl-2 Ser 70的磷酸化水平的改變。以上結(jié)果說明，在亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡的過程中，內(nèi)源性線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮了重要的作用，Bcl-2家族成員Bax，Bak，Bad，Bcl-xL在此凋亡信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)中發(fā)揮有重要的作用。 在對MAPK家族中的主要成員(Erk，p38 MAPK，JNK)研究

4、時發(fā)現(xiàn)，20 μ M亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡過程中，Erk和JNK活性隨亞硒酸鈉誘導時間的增加而逐漸降低，而p38 MAPK的活性則由24小時起顯著升高。同時發(fā)現(xiàn)Erk信號通路幾種上下游信號分子活性同時改變：MEK活性下調(diào)，p90 RSK活性下調(diào)，Raf Ser 338磷酸化水平下調(diào)，證明在亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡過程中Erk信號通路的整體下調(diào)，說明此通路起著重要作用。進一步應(yīng)用特異性抑制劑PD98059，SB203580，SP60

5、0125預處理NB4細胞后發(fā)現(xiàn)，MEK抑制劑PD98059可以有效抑制亞硒酸鈉誘導的NB4凋亡，Erk激活劑TPA則可以促進NB4細胞凋亡。而p38 MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125對亞硒酸鈉誘導的NB4細胞凋亡沒有顯著影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MEK抑制劑PD98059對亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡的影響和其加入的順序有關(guān)，僅在亞硒酸鈉處理NB4細胞以前加入PD98059會對NB4凋亡產(chǎn)生抑制作用，在此后加入的P

6、D98059反而促進亞硒酸鈉誘導的NB4細胞凋亡。上述結(jié)果表明在亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡的過程中，Erk發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，其活性在凋亡早期是促進凋亡的，而在晚期是抑制凋亡的；本研究所設(shè)定的實驗條件下，p38 MAPK和JNK對亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用并不明顯，其對亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡的長期效應(yīng)有待進一步研究。在對Akt的研究中發(fā)現(xiàn)，20 μ M亞硒酸鈉處理NB4細胞可以引發(fā)Akt活性的迅速下調(diào)，其變化明顯早于上述

7、三種MAPK的變化。同時發(fā)現(xiàn)其上游信號激酶PDK1和下游底物Raf Ser 259磷酸化、Bad Ser 136和GSK-3 β Ser 9磷酸化水平均迅速發(fā)生下調(diào)，證明了在亞硒酸鈉誘發(fā)NB4細胞凋亡中Akt信號通路的整體下調(diào)，同時還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)Akt信號通路中重要上游負調(diào)控蛋白PTEN Ser380的磷酸化水平下降。應(yīng)用P13K特異性抑制劑LY294002進行研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用LY294002作用NB4細胞就可以誘發(fā)NB4細胞發(fā)生凋亡，作

8、用呈現(xiàn)劑量依賴性：同時LY 294002可以加強亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡的作用。應(yīng)用LY 294002抑制Akt活性可以下調(diào)Erk活性及Bad Ser 112磷酸化水平，同時顯著上調(diào)p38 MAPK和JNK活性，顯示了NB4細胞中不同激酶信號通路之間的交叉作用。根據(jù)上述結(jié)果可以推斷：Akt活性是人急性早幼粒白血病細胞株NB4細胞的存活所必需的，Akt活性下調(diào)將誘發(fā)NB4細胞走向細胞凋亡；Akt活性下調(diào)是亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡的過程

9、中的一個非常重要的早期事件，Akt活性的下調(diào)隨后誘發(fā)了下游眾多凋亡事件，包括Erk活性下調(diào)，Bad Ser 112和Ser 136去磷酸化，p38 MAPK激活等一系列事件，最終誘發(fā)細胞凋亡。 同時，研究了Akt和Erk，p38 MAPK，JNK在不同濃度亞硒酸鈉作用NB4細胞中可能發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示：在低濃度(5μM以下)的亞硒酸鈉作用下，Erk和Akt的活性都發(fā)生了上調(diào)，在高濃度(10 μ M以上)時亞硒酸鈉可以以濃度依賴