威靈仙皂苷誘導(dǎo)急性早幼粒細胞白血病NB-,4-細胞凋亡及其機制的探討.pdf

1、目的:探討威靈仙皂苷對NB4細胞的凋亡誘導(dǎo)作用和可能機制及對PML-RARa mRNA的影響,并探討其用于白血病治療的可能性,為開發(fā)新的抗腫瘤新藥提供理論依據(jù)。方法:根據(jù)文獻提取威靈仙皂苷,以0.01％DMSO為陰性對照,1.0umol/l的三氧化二砷為陽性對照,各個濃度的威靈仙皂苷為實驗組。將0.01％DMSO、1.0umol/l的三氧化二砷及不同濃度的威靈仙皂苷分別加入NB4細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng),使皂苷在反應(yīng)體系中的終濃度為10ug/m

2、l、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml,每組五個平行對照,并重復(fù)三次實驗。取出培養(yǎng)24、48、72小時后的NB4細胞,加入MTT液,測量A值,計算細胞生長抑制率及IC50值,找出最適濃度。將NB4細胞分別加入含30ug/ml威靈仙皂苷、0.01％DMSO、1.0umol/l三氧化二砷的培養(yǎng)體系中培養(yǎng),分別培養(yǎng)24、48、72小時后(每組三個平行對照,并重復(fù)試驗三次),采用Wright's-Giemsa染色各

3、組NB4細胞,并在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并照相。將NB4細胞分別加入含30ug/ml威靈仙皂苷、0.01％DMSO、1.0umol/l三氧化二砷的培養(yǎng)體系中培養(yǎng),分別培養(yǎng)24、48小時后(每組三個平行對照,并重復(fù)試驗三次),取1×105個細胞,加入500ul的Binding Buffer懸浮細胞,加入5ul Annexin V-FITC混勻后,加入5ul Propidium iodide混勻,室溫、避光、反應(yīng)20min,用流式細胞

4、儀檢測凋亡率。將NB4細胞分別加入含30ug/ml威靈仙皂苷、0.01％DMSO的培養(yǎng)體系中培養(yǎng),分別培養(yǎng)24、48小時后(每組三個平行對照,并重復(fù)試驗三次),取1×105個細胞經(jīng)75％乙醇固定后,加入含RNA酶的PI染液,檢測細胞周期分布。將NB4細胞分別加入含30ug/ml威靈仙皂苷、0.01％DMSO的培養(yǎng)體系中培養(yǎng),分別培養(yǎng)24、48、72小時后(每組三個平行對照,并重復(fù)試驗三次),取1×106個細胞提取RNA,用Real—ti

5、me PCR法檢測NB4細胞中的PML-RARa mRNA。結(jié)果:不同濃度的威靈仙皂苷作用細胞后,均能抑制細胞生長,且隨藥物濃度及干預(yù)時間的延長,抑制率逐漸增加,兩兩比較P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義,但抑制率均小于三氧化二砷組。經(jīng)計算各時間段皂苷的IC50值分別為:干預(yù)24小時組為:247.91ug/ml；干預(yù)48小時組為:30ug/ml；干預(yù)72小時組為4.00ug/ml,選擇濃度為30ug/ml的皂苷為最適濃度。威靈仙皂苷作用的N

6、B4細胞,經(jīng)形態(tài)學檢查發(fā)現(xiàn)細胞體積變小,細胞核高度濃縮聚集,甚至斷裂形成凋亡小體,胞漿疏松、空泡化,與三氧化二砷組有同樣的變化。威靈仙皂苷作用的NB4細胞經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),凋亡率也隨干預(yù)時間的延長而增加,組間p<0.05,差異有統(tǒng)計學意義,凋亡率高于對照組但小于三氧化二砷組。威靈仙皂苷作用的NB4細胞經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞周期大多阻滯于G2期,且以皂苷干預(yù)48小時組較明顯,統(tǒng)計學分析P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義,皂苷干預(yù)48小時

7、組的G2期明顯高于對照組及皂苷干預(yù)24小時組。威靈仙皂苷作用后的NB4細胞PML-RARa mRNA的表達,藥物作用前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),且隨時間變化差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明威靈仙皂苷不影響PML-RARa mRNA的表達。結(jié)論:威靈仙皂苷能抑制細胞生長,且呈時間和濃度依賴性。威靈仙皂苷能誘導(dǎo)細胞凋亡,呈明顯時間依賴性,但凋亡率小于三氧化二砷組。威靈仙皂苷抑制細胞生長和誘導(dǎo)凋亡的最適濃度和最佳作用時間分別