威靈仙皂苷誘導(dǎo)MR-,2-細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究威靈仙皂苷是否能夠誘導(dǎo)耐全反式維甲酸急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株(MR2細(xì)胞株)凋亡,以期望尋找一種治療急性早幼粒細(xì)胞白血病耐藥患者的新藥,盡可能的減輕臨床癥狀,提高生存質(zhì)量,防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,延長(zhǎng)生存期。
　　 方法:根據(jù)文獻(xiàn)自行提取威靈仙皂苷。常規(guī)培養(yǎng)人MR2細(xì)胞株于含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的25ml培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3～5天傳代一次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)對(duì)象

2、,將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔酶標(biāo)板,每孔加細(xì)胞懸液100ul,共設(shè)8個(gè)實(shí)驗(yàn)組(每組5個(gè)平行孔,并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次),以終濃度0.01％DMS0為空白對(duì)照組,終濃度1.0umol/l亞砷酸為陽(yáng)性對(duì)照組,終濃度200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威靈仙皂苷為實(shí)驗(yàn)組,用WST-1法觀察不同濃度不同時(shí)間威靈仙皂苷對(duì)MR2細(xì)胞的增殖抑制作用；調(diào)整細(xì)

3、胞濃度為1×106個(gè)/ml接種子六孔板,設(shè)五個(gè)實(shí)驗(yàn)組(每組設(shè)三個(gè)平行對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次),以終濃度0.01％DMSO為空白對(duì)照組,終濃度1umol/ml亞砷酸為陽(yáng)性對(duì)照組,終濃度800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威靈仙皂苷為實(shí)驗(yàn)組,作用MR2細(xì)胞72小時(shí)后用流式細(xì)胞儀觀察MR2細(xì)胞的凋亡率；調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml接種于六孔板,設(shè)五個(gè)實(shí)驗(yàn)組(每組設(shè)三個(gè)平行對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次),以終濃度0.01％DMSO為空

4、白對(duì)照組,終濃度1umol/1亞砷酸為陽(yáng)性對(duì)照組,終濃度200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威靈仙皂苷為實(shí)驗(yàn)組,作用MR2細(xì)胞72小時(shí)后用AnnexinV-FITC染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài),并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 結(jié)果:WST-1法結(jié)果顯示不同濃度的威靈仙皂苷(200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000

5、ug/ml、1200ug/ml)對(duì)MR2細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用,且呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性?？擅黠@抑制MR2細(xì)胞的增殖并隨著威靈仙皂苷濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而抑制作用增強(qiáng),且高濃度的威靈仙皂苷組與亞砷酸組對(duì)MR2細(xì)胞增殖抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)可明顯檢測(cè)到MR2細(xì)胞的凋亡且隨濃度的增加而凋亡率升高,亞砷酸組與皂苷1200ug/ml組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；亞砷酸組和皂苷1200ug/ml組與皂苷800ug/ml、1000

6、ug/ml組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；皂苷800ug/ml組與皂苷1000ug/ml組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AnnexinV是一種分子量為35～36KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,可在細(xì)胞凋亡時(shí)與翻向外側(cè)的磷脂酰絲氨酸胞膜結(jié)合,使其熒光信號(hào)呈綠光；PI作為一種核酸染料,它不能通過(guò)完整的細(xì)胞膜,但在細(xì)胞凋亡時(shí)和細(xì)胞死亡時(shí)能通過(guò)細(xì)胞膜使細(xì)胞核染色,其熒光信號(hào)呈紅光。通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到威靈仙皂苷作用MR2細(xì)胞經(jīng)An