丹參酮ⅡA誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞性白血病分化機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 通過(guò)對(duì)丹參酮(T8nshinone，Tan ⅡA)與全反式維甲酸(ATRA)及三氧化二砷(As<,2>O<,3>)誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)細(xì)胞分化在細(xì)胞學(xué)、免疫表型和分子生物學(xué)水平的比較，探討Tan Ⅱ A誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用Tan Ⅱ A治療APL奠定理論基礎(chǔ)。 方法： 1. 細(xì)胞培養(yǎng) 10％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)NB<,4>細(xì)胞，分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB<,

2、4>細(xì)胞4×10<'5>個(gè)，分別加入不同濃度的三種藥物，設(shè)7組，分別是濃度為1.70、2.55、3.40μ mol/L(0.5、0.75、1.0μ g/ml)的三個(gè)TanⅡA組、濃度為0.1 μ mol/L As<,2>O<,3>組、1 μ mol/L As<,2>O<,3>組、1.0 μ mol/L ATRA組和濃度為0.01％DMSO對(duì)照組。分別觀察、檢測(cè)培養(yǎng)12h、24h、48h、72h、86h、120h、144h、168h等不同

3、時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)。 2. NB<,4>細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取各組各時(shí)間段NB<,4>細(xì)胞，用臺(tái)盼蘭拒染法在光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。 3. NB<,4>細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)觀察及分化抗原的檢測(cè) 取各組各時(shí)間段NB<,4>細(xì)胞，PBS洗滌后，加小牛血清涂片，姬木薩--瑞氏染色后細(xì)胞形態(tài)觀察；同時(shí)將細(xì)胞用PBS洗兩遍，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10<'4>/mL。取100 μl細(xì)胞懸

4、液，分別加入鼠抗人的PE標(biāo)記的CD<,11b>、和FITC標(biāo)記的CD33的抗體10 μl，室溫放置10min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分化抗原(CD<,33>、CD<,11b>)表達(dá)檢測(cè)。 4. NB<,4>細(xì)胞PML/RAR α融合基因mRNA的檢測(cè) 取各組各時(shí)間段NB<,4>細(xì)胞，用trezol法提取NB<,4>細(xì)胞tRNA，用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)NB4細(xì)胞中PML/RAR α mRNA。 5. NB<,4>細(xì)

5、胞PML-PAR α融合蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 取各組部分時(shí)間段NB<,4>細(xì)胞，同時(shí)以正常粒細(xì)胞作為對(duì)照組，采用western blotting檢測(cè)PML-RAR α融合蛋白。 6. NB<,4>細(xì)胞內(nèi)PML蛋白觀察 取各組部分時(shí)間段NB<,4>細(xì)胞，同時(shí)以正常粒細(xì)胞作為對(duì)照組，將NB<,4>細(xì)胞離心涂片，按操作規(guī)程進(jìn)行固定、Triton 100打孔、抗PML抗體(PG-M<,3>)、FITC標(biāo)記的二抗的等處理后，

6、在熒光顯微鏡下觀察并采圖。觀察PML熒光顆粒的數(shù)量、形態(tài)和大小并相對(duì)量化核小體恢復(fù)情況。 7.分化相關(guān)蛋白C/EBP β的檢測(cè) 取各組部分時(shí)間段NB<,4>細(xì)胞，裂解核蛋白并通過(guò)Bio-Rad測(cè)定，定量后核蛋白加入Laemmli緩沖液煮沸，在10％的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，加一抗抗C/EBP β抗體(鼠抗人)，孵育后加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(羊抗鼠)，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，GAPDH做內(nèi)對(duì)照，計(jì)算灰

7、度值，對(duì)C/EBP β蛋白進(jìn)行半定量測(cè)定。 結(jié)論： 1. TanⅡA可誘導(dǎo)NB<,4>細(xì)胞向成熟方向分化，分化作用隨劑量和作用時(shí)間增加而增加，以2.55 μ mol/L TanⅡA為最佳濃度，以120h為最佳作用時(shí)間。TanⅡA誘導(dǎo)NB<,4>細(xì)胞分化的能力在初期稍弱于ATRA，120h后與ATRA相當(dāng)；TanⅡA誘導(dǎo)NB<,4>細(xì)胞分化的能力強(qiáng)于As<,2>O<,3>。 2. TanⅡA能使NB<,4>細(xì)胞PM