銻劑治療急性早幼粒細胞白血病的優(yōu)勢作用研究.pdf

1、目的:
　　1）研究銻劑在治療急性早幼粒細胞白血病(APL)中的作用，探究銻劑對急性早幼粒細胞白血病相關(guān)蛋白的影響，進而證明銻劑具有治療APL作用。
　　2）通過探討銻劑對PML突變體（例如A216V和L218P;砷劑耐藥性突變體）的降解作用，發(fā)現(xiàn)具有更強降解PML突變體的銻化合物。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)急性早幼粒細胞白血病NB4細胞后，使用三氧化二銻（簡稱銻劑）或砷劑（陽性對照）暴露NB4細胞，通過MTT法，瑞氏-吉姆

2、薩染料染色，流式細胞術(shù)，Western Blot，免疫熒光等方法檢測NB4細胞的增值抑制，分化、凋亡等指標變化。使用免疫熒光法檢測銻劑對核小體形成的影響。利用HEK293T或HeLa細胞，轉(zhuǎn)染Flag-PML或Flag-PML-RARα基因，過表達PML或PML-RARα融合蛋白，研究銻劑（或砷劑）對PML蛋白的溶性改變和降解作用。主要以RIPA buffer和LDS buffer分別提取可溶上清蛋白（RIPA可溶部分）和不溶沉淀蛋白（

3、RIPA不可溶部分）。使用Western Blot法分別檢測PML和PML-RARα融合蛋白在RIPA可溶和不溶部分中的變化和后修飾變化。
　　結(jié)果:
　　1）銻劑對NB4細胞的作用結(jié)果;MTT和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，銻劑的細胞毒性明顯弱于砷劑，而且銻劑有較強的誘導(dǎo)NB4細胞CD11b的表達（早有粒細胞分化標志蛋白）。同時，還發(fā)現(xiàn)銻劑可使NB細胞核形態(tài)變化，證明銻劑具有較強的誘導(dǎo)NB4細胞分化作用。隨著銻劑暴露濃度的增加，胞形

4、態(tài)出現(xiàn)了凋亡的特征，證明銻劑具有一定的誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。Western Blot和免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示，銻劑同樣可導(dǎo)致PML-RARα融合蛋白的溶性發(fā)生改變，最終降解其蛋白融合蛋白;而且出現(xiàn)大顆粒狀的PML核小體，并且與SUMO-1共定位于細胞核，提示銻劑可促使PML-RARα融合蛋白進入PML核小體，進而促進融合蛋白的降解，其作用類似于砷劑。
　　2）銻劑對PML或PML-RARa過表達293T細胞體系實驗結(jié)果;分別用不同濃

5、度的銻劑或不同時間處理PML和PML-RARa過表達293T細胞，銻劑同樣能夠改變PML或PML-RARa融合蛋白的溶性改變，與NB4細胞實驗結(jié)果相吻合。
　　3）銻劑和PSO（銻化合物）對PML突變體的作用結(jié)果;銻劑和砷劑都無法誘導(dǎo)PML突變體(A216V或L218P)的溶性改變或降解，而新型銻化合物PSO具有較強的誘導(dǎo)PML突變體的溶性發(fā)生改變。
　　結(jié)論:銻劑具有類似于砷劑誘導(dǎo)急性早幼粒細胞白血病NB4細胞的分化的作用