重組反義c-myc腺病毒對人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用.pdf

1、c-myc是惡性腫瘤中失常頻率最高的癌基因之一,許多惡性腫瘤的發(fā)生、演變與c-myc的異常高表達(dá)有關(guān).在人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞中c-myc異常高表達(dá)是惡性腫瘤細(xì)胞維持生長的重要原因,與臨床急性早幼粒白血病的發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切.c-myc基因表達(dá)異?？梢宰钄囿w外造血細(xì)胞進(jìn)行分化的過程,實(shí)驗(yàn)證實(shí)阻斷細(xì)胞分化功能的位點(diǎn)與c-myc蛋白惡性轉(zhuǎn)化的作用位點(diǎn)幾乎是一樣的.細(xì)胞體外進(jìn)行分化時(shí),c-myc基因表達(dá)明顯下降,高表達(dá)的c-myc基

2、因則干擾細(xì)胞分化過程.反義核酸技術(shù)為抑制c-myc的高表達(dá)提供一種良好的途徑.它比基因敲除(gene knockout)、基因替換(gene replacement)等方法更簡單易行,有利于臨床應(yīng)用.通過腺病毒載體構(gòu)建重組病毒,具有靶細(xì)胞廣泛;對增殖、靜止期細(xì)胞都可轉(zhuǎn)染;不會產(chǎn)生突變;外源基因裝載量大等諸多優(yōu)點(diǎn).已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)治療.白血病細(xì)胞表面缺少腺病毒纖毛蛋白受體,限制了其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率.近年通過對腺病毒表面纖毛蛋白的改造及輔助轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)

3、的使用,這一問題得到不斷改進(jìn).使腺病毒載體在腫瘤的基因治療的范圍得到擴(kuò)大.目的:通過多聚陽離子輔助重組Lac-Z腺病毒載體(Ad-LacZ)轉(zhuǎn)染急性早幼粒HL-60細(xì)胞,嘗試提高重組腺病毒載體對HL-60細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率.利用重組反義c-myc腺病毒載體(Ad-Asc-myc)轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)其分化,研究其分化過程的分子機(jī)制.探討反義c-myc腺病毒載體用于急性白血病基因治療中的可能性.方法:將多聚陽離子與Ad-LacZ混合轉(zhuǎn)染HL

4、-60細(xì)胞,通過X-gal染色觀察LacZ基因表達(dá),得出轉(zhuǎn)染效率.Ad-Asc-myc與多聚陽離子混合轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞,利用RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察其對轉(zhuǎn)染細(xì)胞c-myc轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的影響.MTT、臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測Ad-Asc-myc對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長及活力的影響,Wright's染色觀察細(xì)胞形態(tài)的變化.NBT、非特異酯酶染色了解細(xì)胞的分化功能變化,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞周期分布、細(xì)胞分化抗原CD<,13>及CD

5、<,33>的變化,免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察分化、增殖相關(guān)基因PCNA、hTERT和c-fos的表達(dá).結(jié)果:MOI:100, Ad-LacZ組轉(zhuǎn)染效率:35.9﹪,Ad-LacZ+protamine sulfate:79.8﹪Ad-LacZ+polybrene:40.7﹪,多聚陽離子輔助可提高腺病毒對HL-60細(xì)胞的轉(zhuǎn)染, protamine sulfate優(yōu)于polybrene.Ad-Asc-myc降低了c-myc基因在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的表達(dá)

6、.可以抑制HL-60細(xì)胞生長及活力.在細(xì)胞形態(tài)、白細(xì)胞分化抗原及功能上出現(xiàn)粒系分化特征.細(xì)胞周期分析:Ad-Asc-myc轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)G<,0>/G<,1>阻滯,S期細(xì)胞下降.分化增殖相關(guān)基因PCNA、hTERT表達(dá)降低,c-fos基因表達(dá)增強(qiáng).結(jié)論:Ad-Asc-myc在多聚陽離子輔助下能有效轉(zhuǎn)染人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞.轉(zhuǎn)染后能降低HL-60細(xì)胞c-myc的表達(dá).抑制HL-60細(xì)胞的生長,使細(xì)胞阻滯于G<,0>/G<,1>期,