CRT高表達對二烯丙基二硫誘導人白血病HL-60細胞分化的影響.pdf

1、目的：研究鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin,CRT）高表達對二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）誘導人白血病HL-60細胞分化的影響以及與分化相關(guān)的分子機制。
　　方法：運用RT-PCR、Western blot實驗方法觀察DADS作用HL-60細胞后CRT和其相關(guān)分子C/EBPα的變化情況。通過構(gòu)建CRT高表達質(zhì)粒，將CRT高表達質(zhì)粒 pcDNA3.1-12GS0643-IG-3轉(zhuǎn)入 HL-60細胞內(nèi)

2、，探討 CRT對DADS誘導HL-60細胞分化的影響。通過NBT還原實驗、MTT比色法、Transwell實驗進一步觀察CRT高表達和DADS作用對HL-60細胞還原能力、增殖能力及遷移、侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.DADS對人白血病HL-60細胞CRT表達的影響
　　Western blot、RT-PCR實驗數(shù)據(jù)表明，以濃度為1.25 mg·L-1DADS分別作用HL-60細胞12h、24h、48h后，同未

3、用DADS處理組相對比，隨著DADS處理時間的延長，CRT在蛋白水平和mRNA水平的表達呈逐漸下降的特點（P<0.05）。
　　2. DADS對HL-60細胞C/EBPα表達的影響
　　Western blot、RT-PCR實驗數(shù)據(jù)表明，以濃度為1.25 mg·L-1DADS分別作用HL-60細胞12h、24h、48h后，同不用DADS處理組相對比，隨著DADS處理時間的延長， C/EBPα在 mRNA水平和蛋白水平的表達呈

4、逐漸升高的特性（P<0.05）。
　　3. DADS對HL-60細胞遷移能力的影響
　　遷移實驗表明，用DADS分別作用人白血病HL-60細胞12、24h后，使其終濃度為1.25 mg·L-1，同未用DADS處理組相比較，HL-60細胞的遷移能力隨時間的延長而逐漸減弱（P<0.05）。
　　4. CRT高表達對DADS作用HL-60細胞CRT表達的影響
　　將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 HL-60細胞，置于二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中

5、培養(yǎng)48h后，置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，可見細胞發(fā)綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功。
　　RT-PCR實驗結(jié)果顯示，CRT高表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HL-60細胞CRT基因水平與轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組相比升高，且在DADS作用后，各實驗組的CRT基因水平與未處理時相比均有所下降。
　　Western blot顯示，轉(zhuǎn)染CRT高表達質(zhì)粒的HL-60細胞其CRT蛋白表達水平與陰性轉(zhuǎn)染組相比升高，用1.25 mg·L-1DADS處理各實驗組后，各組的CR

6、T蛋白水平與未處理時相比均有所下降。
　　RT-PCR與Western blot表明，1.25 mg·L-1DADS處理陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和高表達組48h后，CRT的mRNA和蛋白表達水平跟未處理的陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和高表達組比較均明顯降低（P<0.05）。表明高表達CRT mRNA和蛋白水平均高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，且DADS能抑制CRT表達。
　　5. CRT高表達對DADS作用HL-60細胞C/EBPα表

7、達的影響
　　將CRT高表達質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染HL-60細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，于熒光顯微鏡下觀察，能看到轉(zhuǎn)染細胞發(fā)綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功。
　　RT-PCR實驗顯示，CRT高表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HL-60細胞C/EBPα基因水平與轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組相比下降，且在DADS作用后，各實驗組的C/EBPα基因水平與未處理時相比均有所升高。
　　Western blot顯示，轉(zhuǎn)染CRT高表達質(zhì)粒的HL-60細胞其C/E

8、BPα蛋白表達水平與陰性轉(zhuǎn)染組相比下降，用1.25 mg·L-1DADS處理各實驗組后，各組的CRT蛋白水平與未處理時相比均有所升高。
　　RT-PCR與Western blot表明，1.25 mg·L-1DADS處理陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和高表達組48h后，C/EBPα的mRNA和蛋白表達水平跟未處理的陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和高表達組比較均明顯增高（P<0.05）。表明 CRT高表達組C/EBPα miRNA和蛋白水平均低于

9、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，且DADS能增加C/EBPα表達。
　　6. CRT高表達對DADS作用HL-60細胞誘導其分化的影響
　　NBT實驗顯示，在各時間段，CRT高表達組還原能力均弱于陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，分別用1.25mg L-1DADS和ATRA處理CRT高表達HL-60細胞，較未處理前相比，細胞的還原能力明顯增強(P<0.05)，其中1.25mg L-1 DADS與ARTA比較其效果類似(P＞0.05)。

10、>　　MTT實驗顯示，經(jīng)DADS處理后，CRT高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞的增殖與處理前相比均受到抑制(P<0.05)，表明DADS能抑制HL-60細胞的增殖。
　　Transwell侵襲實驗表明，同未處理的CRT高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組相比，經(jīng) DADS處理后的各組穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)比處理前均明顯減少（P<0.05）；未轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組無明顯差異（P>0.05）。表明DADS能對HL-60細胞的侵襲能力產(chǎn)生抑制作用