二烯丙基二硫抗人白血病HL-60細(xì)胞作用及機(jī)制的研究.pdf

1、最近的研究結(jié)果表明，各類型的白血病均高表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，進(jìn)展期及晚期白血病病人VEGF表達(dá)更高。抑制白血病細(xì)胞生成和釋放VEGF有可能抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，改善患者的預(yù)后。survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子。在ALL、AML、CML加速期和急變期的原代白血病細(xì)胞中也檢測(cè)到survivin蛋白的過表達(dá)。 二烯丙基二硫(diallyl

2、 disulfide，DADS)是大蒜中的一種脂溶性的有效成分，對(duì)白血病細(xì)胞有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)將探討二烯丙基二硫?qū)θ税籽L-60細(xì)胞的作用過程中VEGFmRNA的表達(dá)及VEGF蛋白分泌的改變，研究二烯丙基二硫抑制人白血病HL-60細(xì)胞生長的機(jī)制；同時(shí)探討是否伴隨著SUFVivin蛋白表達(dá)的變化，為DADS抗腫瘤臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分 二烯丙基二硫?qū)θ税籽L-60細(xì)胞VEGF表達(dá)及分泌的影響目的：探討二烯

3、丙基二硫(DADS)對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞的生長抑制作用和HL-60細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)mRNA的表達(dá)及VEGF蛋白分泌的變化。 方法：采用MTT法觀察DADS對(duì)體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞的生長抑制；應(yīng)用ELISA法檢測(cè)藥物作用前后HL-60細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白的含量；半定量RT-PCR法檢測(cè)藥物作用前后HL-60細(xì)胞ⅦGF mRNA。 結(jié)果：DADS對(duì)HL-60細(xì)胞具有明顯的生長抑制效應(yīng)，其對(duì)H

4、L-60細(xì)胞的生長抑制率與藥物濃度有明顯依賴關(guān)系(r>0.9，P<0.01)，各實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間增加抑制率明顯增加(r>0.7，P<0.01)；DADS三個(gè)濃度組(0.625，1.25，2.5 μg/mL)作用HL-60細(xì)胞48h和72h與空白對(duì)照相比均能下調(diào)HL-60細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)及VEGF蛋白的分泌(P<0.01)，DADS三個(gè)濃度組組間差異具有顯著性(P<0.01)，其下調(diào)HL-60細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)及VEGF蛋白

5、的分泌效果與濃度相關(guān)(r>0.9，P<0.01)。 結(jié)論：DADS能明顯抑制人白血病HL-60細(xì)胞的增殖：DADS可能通過抑制人白血病HL-60細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)及VEGF蛋白分泌發(fā)揮抗白血病的效應(yīng)。 第二部分 二烯丙基二硫?qū)θ税籽L-60細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制探討 目的：探討二烯丙基二硫(DADS)對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞增殖的影響及survivin蛋白表達(dá)的變化和細(xì)胞周期的改變之間的關(guān)系

6、，從而探討DADS的抗白血病機(jī)制。 方法：采用MTT法觀察DADS對(duì)體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用SP-免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)DADS作用前后HL-60細(xì)胞內(nèi)survivin蛋白的含量；同時(shí)用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。 結(jié)果：DADS對(duì)HL-60細(xì)胞具有明顯的生長抑制效應(yīng)。其對(duì)HL-60細(xì)胞的生長抑制率與藥物濃度、時(shí)間有明顯依賴關(guān)系(r>0.9，P<0.01)。0.625μg/mL DADS干預(yù)HL-6

7、0細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞生長抑制率為8.94％，隨著濃度增加，時(shí)間延長，20.0 μg/mL的DADS作用HL-60細(xì)胞72小時(shí)后，細(xì)胞抑制率升高至70.66％。SP免疫組化顯示空白對(duì)照組及DMSO溶媒對(duì)照組均有survivin蛋白的高表達(dá)，其染色強(qiáng)度指數(shù)(SII)分別為1125及1126，兩者無顯著性差異(P>0.05)。5、10、20 ug/mL的DADS作用于HL-60細(xì)胞24、48及72小時(shí)能呈時(shí)間、濃度依賴性下調(diào)survivin蛋

8、白的表達(dá)(r>0.9，P<0.01)，20 μg/mL的DADS作用于HL-60細(xì)胞72小時(shí)，SII為119，survivin蛋白表達(dá)抑制最為明顯。DADS三個(gè)濃度組間survivin蛋白表達(dá)均有顯著性差異(P<0.01)，與空白對(duì)照組比較也均有顯著性差異(P<0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示，伴隨著survivin蛋白的下調(diào)，DADS可呈濃度、時(shí)間依賴性阻滯細(xì)胞于G2/M期(r>0.9，P<0.01)。20 μg/mL的DADS作用

9、于HL-60細(xì)胞72小時(shí)G2/M期細(xì)胞比例達(dá)最高峰，為66.56％。 結(jié)論：DADS能明顯抑制人白血病HL-60細(xì)胞的增殖；DADS下調(diào)survivin蛋白，并使人白血病HL-60細(xì)胞阻滯于G2/M期。 綜上所述，DADS能明顯抑制人白血病HL-60細(xì)胞的增殖；DADS可能通過抑制人白血病HL-60細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)及VEGF蛋白分泌發(fā)揮抗白血病的效應(yīng)。DADS同時(shí)下調(diào)survivin蛋白，并使人白血病HL-6