白血病與非白血病骨髓間充質(zhì)干細胞對HL-60細胞影響的比較研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)是繼造血干細胞之后發(fā)現(xiàn)的另一類骨髓成體干細胞，具有重要的造血調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)作用。對正常的造血干細胞(HSC)和白血病細胞都產(chǎn)生影響。 目的： 1.探討非白血病MSC對人類急性髓性白血病(AML)細胞系HL-60細胞增殖分化的影響以及相關(guān)分子機制。 2.比較急性髓性白血病MSC，急性髓性白血病完全緩解后MSC以及非白血病MSC的部分生物學(xué)特性。 3.比較急性髓性白血病MSC，急性髓

2、性白血病完全緩解后MSC以及非白血病MSC對HL-60細胞影響。 方法： 第一部分 1.應(yīng)用密度梯度離心法從非白血病骨髓中分離單個核細胞，進一步貼壁培養(yǎng)分離：MSC。建立MSC細胞層后，直接將HL-60細胞種植于MSC細胞層上，兩者共培養(yǎng)。 2.應(yīng)用直接計數(shù)法，在不同時間計數(shù)單獨培養(yǎng)的和與MSC共培養(yǎng)的HL-60細胞，描繪其時間-數(shù)量曲線。 3.應(yīng)用流式細胞儀檢測與MSC共培養(yǎng)的HL-60細胞和單

3、獨培養(yǎng)的HL-60細胞的細胞周期以及凋亡的細胞比例。 4.應(yīng)用流式細胞儀檢測與MSC共培養(yǎng)的HL-60細胞和單獨培養(yǎng)的HL-60細胞的CD11b與CD14的表達。 5.應(yīng)用流式細胞儀檢測與MSC共培養(yǎng)HL-60細胞和單獨培養(yǎng)的HL-60細胞Survivin蛋白和Bcl-2蛋白的表達。 6.瑞氏染色后光鏡下觀察與MSC共培養(yǎng)后的HL-60細胞，并計算分化率，以單獨培養(yǎng)的HL-60為對照。 7.吞墨實驗檢測與

4、MSC共培養(yǎng)后的HL-60細胞的功能。 第二部分 1.原位瑞氏染色觀察急性髓性白血病MSC，急性髓性白血病完全緩解MSC以及非白血?。篗SC的細胞形態(tài)。 2.原位瑞氏染色后計數(shù)CFU-F的個數(shù)。 3.計數(shù)從種植單個核細胞到MSC細胞融合的時間。 4.采用直接計數(shù)法，在不同時間計數(shù)以上各組MSC的數(shù)量，并描繪其時間-數(shù)量曲線。 5.流式細胞儀檢測各組MSC的免疫表型和細胞周期并計算DI值。

5、 6.采用直接計數(shù)法，在不同時間計數(shù)與各組MSC共培養(yǎng)的HL-60細胞并比較。 7.流式細胞儀檢測與各組MSC共培養(yǎng)的HL-60細胞的CD11b和Survivin蛋白表達，以及細胞周期分布并比較。 8.瑞氏染色后光鏡下觀察與各組MSC共培養(yǎng)后的HL-60細胞形態(tài)，計算分化率并比較。統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用STATA統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組變量記錄為均數(shù)土標準差。非白血病MSC共培養(yǎng)的HL-60細胞與單獨培養(yǎng)的HL-60細胞

6、之間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，與不同組MSC共培養(yǎng)后HL-60細胞之間的數(shù)據(jù)比較采用方差分析。各個指標之間的相關(guān)性評估采用簡單線性回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 第一部分 1.非白血病MSC與HL-60細胞共培養(yǎng)后，HL-60細胞的增殖明顯受抑，這種作用在5-7天顯著(第3天比較P=0.07，第5天比較P=0.01，第7天比較P<0.01) 2.細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)與MSC共培養(yǎng)后HL-60細

7、胞分布于G0/G1期比例明顯增加(對照組為47.0±9.0％，實驗組為70.0±16.0％，P=0.003)。并且在G0/G1期左側(cè)出現(xiàn)凋亡峰。 3.HL-60細胞的Survivin蛋白和Bcl-2 蛋白表達，在與MSC共培養(yǎng)后同時下調(diào)(Bcl-2：對照組為63.0±9.1％，實驗組為50.0±14.1％，P=0.045；Survivin：對照組為94.0±9.3％，實驗組為77.0±11.8％，P=0.006)。 4.

8、HL-60細胞的CD11b和CD14表達在與MSC共培養(yǎng)后顯著升高(對照組為陰性，實驗組為25.0±3.2％) 5.HL-60細胞經(jīng)過Survivin與CD11b單克隆抗體雙標后，發(fā)現(xiàn)一群CD11b陽性細胞，Survivin陰性表達的細胞，比例在16.04±4.9％。 6.形態(tài)學(xué)分析，有部分細胞向中晚幼細胞以及單核細胞分化，分化率為18.0±9.0％。 7.與MSC共培養(yǎng)處理后的HL-60細胞吞墨實驗陰性。

9、 第二部分 1.第14天CFU-F 個數(shù)為：白血病組為20.04±2.1個/10<'7>MNC，非白血病組為25.04±3.0個/10<'7>MNC，CR 白血病組為 23.0±4.1個/10<'7>MNC。白血病組MSC的最少，三組比較差異顯著，P=0.01，其他兩組比較差異不顯著，P>0.05。 2.各組MSC的融合時間：白血病組為26.0±3.0天，非白血病組為21.0±1.0天，CR白血病組為22.0±2.0天

10、。白血病組融合時間最長，三組比較差異顯著(P<0.01)。 3.經(jīng)過篩選傳代后的各組MSC增殖狀態(tài)無差異。在第3、5、7天對各組進行細胞計數(shù)比較，P值均大于0.05，無差異。 4.各組MSC的細胞形態(tài)在光鏡水平下無差異。 5.各組MSC的CD105、CD106均為高表達，CD45表達陰性，各組的CD105和CD106表達比較，P值分別為0.37、0.50，無差異。 各組MSC的G0/G1期細胞比例為：白血

11、病組為89.94±4.0％，非白血病組為90.2±3.0％，CR白血病組為91.0±3.0％，三組比較無差異(P=0.79)。 各組MSC的DI值都在0.9-1.1范圍之內(nèi)。 6.與各組MSC共培養(yǎng)后，HL-60的細胞計數(shù)：在第5天和第7天對各組比較無差異，P值分別為：0.77、0.96。 7.與各組MSC共培養(yǎng)后，HL-60細胞周期分布、Survivin表達和CD11b表達比較無差異，P值分別為：0.89、0.

12、08、0.19。 8.HL-60細胞與各組MSC共培養(yǎng)后，細胞的形態(tài)皆向成熟方向轉(zhuǎn)化，分化率分別為18.0±3、117.0±1.3、19.0±2.0，比較無差異(P=0.23)。 結(jié)論： 第一部分 1.骨髓MSC對HL-60細胞的增殖有抑制作用： ①可能通過阻止細胞進入周期循環(huán)或者延緩周期進展速度來實現(xiàn)。 ②可以導(dǎo)致腫瘤細胞的分化，使細胞退出增殖周期。 ③這種抑制作用通過MSC分泌

13、的細胞因子和與HL-60細胞的直接接觸實現(xiàn)的。 2.骨髓MSC可以引起HL-60細胞的凋亡，凋亡是伴隨于分化的，與分化密切相關(guān)。細胞的凋亡伴隨Bcl-2和Survivin的同時下調(diào)，推測兩種凋亡相關(guān)蛋白有相關(guān)性。 3.骨髓MSC對HL-60細胞有促進分化的作用，但是不能完成終端分化。 4.骨髓MSC對HL-60細胞的增殖抑制和促分化作用，對于開辟白血病治療新思路起到一定的作用。但MSC對HL-60的周期阻滯可能會