兩種植物黃酮抗白血病細胞HL-60效應(yīng)及機制研究.pdf

1、白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病率在各種人類腫瘤中占第六位，居年輕人惡性疾病的首位，是一種嚴重威脅人類生命健康的惡性疾病，努力尋找天然、高效的防治藥物以預防和治療白血病，是一項具有重要的現(xiàn)實和理論意義的研究課題。植物黃酮是膳食中一類較為重要的植物化學物，具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等廣泛、優(yōu)良的生物學效應(yīng)，特別是對于腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲、血管生成以及耐藥性等各階段、各方面都具有顯著的抑制作用，植物黃酮抗腫瘤研究一直

2、是國內(nèi)外研究的一個熱點。本課題組前期研究選用23種分子結(jié)構(gòu)明確的常見植物黃酮，對其抗腫瘤效應(yīng)進行了評價和篩選，結(jié)果顯示，3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮具有較強的抗腫瘤效應(yīng)，其抗腫瘤作用及其機制值得深入探討，本課題是在此研究基礎(chǔ)上的進一步深入。 腫瘤細胞最顯著的特點是不受控制的快速增殖特性，能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖是抗腫瘤作用的最基本表現(xiàn)。細胞存活率，即活細胞的比例，反映出該群細胞的整體增殖活力狀況，細胞存活率越高反映出該

3、群細胞的增殖活性越好，反之則表明該群細胞中的死亡細胞、凋亡細胞比例高，細胞整體增殖活性低。細胞凋亡是以細胞核濃縮、染色體DNA被以核小體為單位切成梯狀片段、細胞縮小，最終形成細胞凋亡小體等形態(tài)變化為特征。研究表明，細胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于線粒體膜功能發(fā)生改變，內(nèi)膜跨膜電位消失和線粒體內(nèi)蛋白酶活化物(如細胞色素C)的釋放，激發(fā)各種凋亡相關(guān)的代謝變化，從而啟動凋亡程序。線粒體跨膜電位消失與細胞色素C從線粒體的釋放被認為是細胞凋亡啟動的關(guān)鍵

4、步驟：釋放到細胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下激活caspase家族，從而啟動和執(zhí)行凋亡信號轉(zhuǎn)導。 細胞中抗氧化酶系統(tǒng)的功能對于調(diào)控活性氧(ROS)以及調(diào)節(jié)包括增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)的細胞生命活動具有極其重要的作用。腫瘤細胞內(nèi)的抗氧化酶活性都顯著低于正常細胞，腫瘤細胞清除ROS和生成GSH的能力較低，而腫瘤細胞內(nèi)的ROS水平往往高于正常細胞，降低細胞內(nèi)抗氧化酶活性能夠選擇性殺傷腫瘤細胞，這可能是抗腫瘤藥物發(fā)揮效應(yīng)的重要機制。

5、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPK)信號通路是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來一些研究表明，ROS和氧化應(yīng)激可介導MAPKs信號途徑的改變，誘導細胞凋亡，其中JNK/SAPK和p38MAPK兩條途徑在氧化應(yīng)激的研究中引起廣泛關(guān)注。前期研究表明3，6-二羥黃酮可顯著影響HL-60細胞胞內(nèi)ROS水平，3，6-二羥黃酮是否

6、因此影響MAPK信號通路，值得探討。 基于以上分析，本課題選用前期藥效實驗篩選出的具有較強抗腫瘤效應(yīng)的3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮，觀察兩種植物黃酮化合物對白血病HL-60細胞增殖和凋亡的影響，利用流式細胞分析、激光共聚焦掃描顯微鏡、Western blot等分子生物學檢測分析技術(shù)，檢測3，6-二羥黃酮對HL-60細胞線粒體膜電位水平降低、細胞色素C釋放以及caspase家族激活這一凋亡啟動和執(zhí)行信號轉(zhuǎn)導的影響，同時探討

7、3，6-二羥黃酮誘導HL-60細胞凋亡過程中，對細胞抗氧化酶活性和MAPKs信號通路的影響。 本研究主要實驗結(jié)果和結(jié)論如下： 1.細胞生長曲線結(jié)果顯示，不同劑量的3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮作用于HL-60細胞，細胞增殖能力產(chǎn)生不同程度降低，顯示出濃度-依賴性和時間-依賴性效應(yīng)關(guān)系；10μM濃度的3，6-二羥黃酮和20μM的2’-羥基二氫黃酮能夠有效抑制HL-60細胞的快速增殖，20μM以上濃度的3，6-二羥黃酮

8、則可有效阻止HL-60細胞的增殖，顯示出殺滅HL-60細胞的抗腫瘤活性。與此一致，細胞活力分析結(jié)果表明，3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮能夠劑量、時間-依賴性的降低HL-60細胞的細胞活力。以上結(jié)果表明，3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮能夠顯著降低HL-60細胞的細胞活力，抑制其增殖。 2.細胞形態(tài)學觀察可見，正常HL-60細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)完整，細胞呈珍珠(圓球)形，懸浮生長，細胞排列緊密，大小均勻，組織完整，未見

9、破裂細胞和細胞碎片；3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮處理24h后，HL-60細胞形態(tài)隨處理劑量的增加逐漸呈現(xiàn)出顯著異常，表現(xiàn)為細胞排列稀疏、紊亂，大小不均勻，形態(tài)異常，大量細胞皺縮變圓、胞質(zhì)凝縮或腫大破裂，腫脹細胞、破裂細胞和細胞碎片逐漸增多，這些形態(tài)變化都是凋亡細胞或死亡細胞的表現(xiàn)特征。這表明，3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮作用HL-60細胞后，細胞中死亡細胞、凋亡細胞和細胞碎片大量增加。 3.流式細胞凋亡分析結(jié)果表

10、明，20μM的3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮處理，能夠顯著誘導HL-60細胞發(fā)生凋亡，凋亡細胞比例顯著增高，顯示出良好的抗腫瘤效應(yīng)。進一步研究表明，20μM的3，6-二羥黃酮作用于HL-60細胞，細胞線粒體膜電位水平隨作用時間增加而逐漸降低，并在作用8h后顯著低于正常對照組水平；Westernblot方法檢測胞漿蛋白中細胞色素C的含量，結(jié)果表明，20μM的3，6-二羥黃酮作用后2h即見細胞胞漿中的細胞色素C含量顯著升高，并隨作用時

11、間的增加逐漸增高；這表明3，6-二羥黃酮可誘導HL-60細胞線粒體膜電位顯著降低，并導致線粒體中的細胞色素C大量釋放至胞漿，啟動細胞凋亡。 4.細胞抗氧化酶活性檢測結(jié)果顯示，3，6-二羥黃酮可顯著降低HL-60細胞胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性，并顯著降低SOD的表達，細胞中脂質(zhì)過氧化物MDA水平顯著升高。表明3，6-二羥黃酮可通過降低胞內(nèi)抗氧化酶活性增加HL-60細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激壓力，導致細胞過氧化損傷。

12、 5.Western blot檢測結(jié)果表明，正常對照組HL-60細胞中caspases基本以無活性的酶原狀態(tài)形式存在，裂解活化的caspases(cleaved-caspase3、cleaved-caspase9和cleaved-PARP)水平很低，3，6-二羥黃酮作用后，細胞中caspase3、caspase9、PARP含量逐漸降低，cleaved-caspase3、cleaved-caspase9和cleaved-PARP水平逐漸

13、增高，cleaved-caspases/caspase的比值增高，表明caspases和PARP被裂解活化，凋亡啟動和執(zhí)行的信號轉(zhuǎn)導被顯著激活，細胞進入凋亡程序。 6.Western blot檢測結(jié)果表明，20μM3，6-二羥黃酮作用于HL-60細胞，細胞內(nèi)MAPKs信號通路蛋白表達及磷酸化水平發(fā)生顯著變化，細胞質(zhì)內(nèi)磷酸化ERK在處理2h后顯著下降，至24 h恢復到正常水平；JNK與p38MAPK則表現(xiàn)為磷酸化蛋白水平增高，在處

14、理2h后，磷酸化蛋白含量顯著增加，然后緩慢下降，但24 h內(nèi)仍高于正常水平，提示3，6-二羥黃酮對JNK、p38MAPK信號通路的影響較大。 綜上所述，本研究結(jié)果表明，3，6-二羥黃酮和2’-羥基二氫黃酮能夠有效抑制白血病HL-60細胞增殖，降低HL-60細胞增殖活力，并顯著誘導HL-60細胞凋亡；進一步研究表明，3，6-二羥黃酮可顯著降低HL-60細胞胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活性，使細胞過氧化損傷產(chǎn)物顯著增加，同時降低線粒體膜電位水平