新甾醇類藥物NSC67657誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60單核系分化及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：構(gòu)建新甾醇類藥物NSC6767誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60向單核系分化的細(xì)胞模型，檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響、探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法：以10μmol/L NSC67657藥物處理HL-60細(xì)胞5 d構(gòu)建細(xì)胞分化模型，以DMSO溶劑處理HL-60細(xì)胞5 d為對(duì)照組；采用瑞氏染色、堿性α-丁酸萘酚酯酶（α-NBE）染色分析細(xì)胞的分化方向；采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的分化程度、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡的情況；采用乳酸脫氫酶（

2、LD）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用；采用RT-PCR和Western blot分析ICAT、β-catenin、T細(xì)胞因子4（TCF-4）的mRNA和蛋白在細(xì)胞分化前后的表達(dá)情況；采用Western blot和免疫熒光染色方法檢測(cè)細(xì)胞分化前后β-catenin，TCF-4在細(xì)胞內(nèi)定位情況。采用RT-PCR和Western blot分析Wnt信號(hào)通路下游靶基因c-myc、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、TCF-1 mRNA和

3、蛋白在細(xì)胞分化前后的表達(dá)情況；
　　結(jié)果：瑞氏染色后觀察發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞在10μmol/L NSC67657作用5 d后細(xì)胞質(zhì)明顯增多，核仁消失，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形；α-NBE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組胞質(zhì)無(wú)色，為陰性，實(shí)驗(yàn)組胞質(zhì)中出現(xiàn)鮮紅色的顆粒沉淀，為陽(yáng)性，并能被氟化鈉(NaF)抑制，抑制率>50％。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）結(jié)果顯示：10μmol/L NSC67657作用5 d后的實(shí)驗(yàn)組CD14+細(xì)胞數(shù)為（94.37±2.84）%，高于對(duì)

4、照組[（1.31±0.09）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；實(shí)驗(yàn)組G1/G0期細(xì)胞所占比例為（76.46±2.83）%，高于對(duì)照組[（59.4±5.42）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞所占比例為（18.76±0.98）%，低于對(duì)照組[（34.38±2.61）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；藥物處理前后的HL-60細(xì)胞早期和晚期凋亡均無(wú)明顯改變（均P>0.05）；LD檢測(cè)結(jié)果顯示，LD活性也并無(wú)明顯

5、改變（P>0.05）。RT-PCR、western blot結(jié)果顯示：藥物作用后HL-60細(xì)胞中ICAT表達(dá)水平上調(diào)(均P<0.01)；β-catenin表達(dá)水平下調(diào)(均P<0.01)；細(xì)胞核中β-catenin蛋白的水平下調(diào)(P<0.01)；TCF-4表達(dá)水平無(wú)明顯改變（均P>0.05）；細(xì)胞核中的 TCF-4無(wú)明顯改變（P>0.05）；Wnt信號(hào)通路下游靶基因c-myc、cyclin D1、TCF-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(

6、均P<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示：細(xì)胞核中的β-catenin蛋白減少，TCF-4無(wú)明顯改變。
　　結(jié)論：NSC67657可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞 HL-60向單核系分化，抑制細(xì)胞增殖，但不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用；在HL-60向單核系誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，ICAT表達(dá)上調(diào)，Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子β-catenin及下游靶基因的表達(dá)下調(diào)。提示：ICAT可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了NSC67657誘導(dǎo)白