NLS-RARα基因?qū)L-60細(xì)胞增殖及ATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分重組腺病毒Ad-NLS-RARα的構(gòu)建及其在K562細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:應(yīng)用AdEasy-1腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建含NLS-RARα基因的重組腺病毒Ad-NLS-RARα，并檢測其在K562細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　方法:以pGBKT7-PML-RARα質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增NLS-RARα基因，克隆至腺病毒穿梭載體pAdTrace-TO4中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4-NLS-RARα，經(jīng)PmeI酶切線

2、性化后轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183大腸桿菌感受態(tài)中進(jìn)行同源重組，卡那霉素抗性篩選，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-NLS-RARα，經(jīng)PacI酶切線性化后，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞進(jìn)行包裝，獲得重組腺病毒Ad-NLS-RARα，同時包裝擴(kuò)增陰性對照腺病毒Ad-KZ，經(jīng)4輪擴(kuò)增后，測定腺病毒滴度，經(jīng)PCR和測序驗證;陽性重組腺病毒感染K562細(xì)胞，F(xiàn)CM測定感染效率，RT-P

3、CR和Western blot檢測NLS-RARα基因在K562細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:重組腺病毒Ad-NLS-RARα經(jīng)PCR和測序鑒定構(gòu)建正確;經(jīng)4輪擴(kuò)增后，重組腺病毒Ad-NLS-RARα滴度可達(dá)6.9×108pfu/ml;其對K562細(xì)胞的感染效率可達(dá)70％;RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，重組腺病毒Ad-NLS-RARα攜帶的NLS-RARα基因可以在K562細(xì)胞中高效表達(dá)。
　　

4、結(jié)論:成功包裝并且擴(kuò)增重組腺病毒Ad-NLS-RARα，并且可以在K562細(xì)胞中高效表達(dá)NLS-RARα基因。
　　第二部分重組腺病毒Ad-NLS-RARα對HL-60細(xì)胞增殖及ATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制的研究
　　目的:將已構(gòu)建驗證成功的重組腺病毒Ad-NLS-RARα和陰性對照腺病毒Ad-KZ感染至HL-60細(xì)胞中，探討其對HL-60細(xì)胞增殖及ATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化的影響及機(jī)制。
　　

5、方法:經(jīng)驗證正確的腺病毒經(jīng)Protamine sulfate輔助感染HL-60細(xì)胞，檢測感染效率，用RT-PCR和Western-blot檢測目的基因在HL-60細(xì)胞中的表達(dá)情況。MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。病毒感染HL-60細(xì)胞24h后，用2.5μmol/LATRA處理，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞表面分化抗原CD11b的表達(dá)。RT-PCR和Western-blot檢測C-MYC基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:在Pro

6、tamine sulfate輔助感染作用下，重組腺病毒Ad-NLS-RARα和陰性對照腺病毒Ad-KZ對HL-60細(xì)胞的感染效率可達(dá)70％-80％。NLS-RARα基因的RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，感染了重組腺病毒Ad-NLS-RARα的HL-60細(xì)胞的NLS-RARα基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05)。MTT法檢測表明感染了重組腺病毒Ad-NLS-RARα的細(xì)胞增殖能力增高(P＜0.05)。FCM

7、檢測結(jié)果顯示，經(jīng)ATRA處理后，感染Ad-NLS-RARα重組腺病毒的HL-60細(xì)胞，CD11b表達(dá)較陰性對照組和未感染組下調(diào)(P＜0.05)。C-MYC基因的RT-PCR和Western-blot檢測結(jié)果表明，經(jīng)ATRA處理后，感染Ad-NLS-RARα重組腺病毒的細(xì)胞C-MYC基因的mRNA和蛋白水平均高于其他兩組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:重組腺病毒Ad-NLS-RARα可以促進(jìn)HL-60細(xì)胞的增殖，并通過上調(diào)C-MYC基

8、因的表達(dá)，抑制ATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化。
　　第三部分 RNA干擾NLS-RARα基因?qū)L-60細(xì)胞增殖及分化的影響
　　目的:探討抑制NLS-RARα基因表達(dá)對HL-60細(xì)胞株增殖及分化的影響。
　　方法:合成針對NLS-RARα的短發(fā)夾RNA(Short hairpin RNA，shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞;經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;RT-PCR及QRT-PCR

9、法檢測各組細(xì)胞NLS-RARα基因mRNA表達(dá)水平;Western-blot法檢測各組細(xì)胞NLS-RARα蛋白表達(dá)水平;MTT法檢測細(xì)胞增殖活性;流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞周期分布和細(xì)胞表面分化抗原CD11b的表達(dá)。
　　結(jié)果:RT-PCR、QRT-PCR和Western-blot結(jié)果表明干擾組HL-60細(xì)胞NLS-RARαmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05); MTT法結(jié)果表明干擾組細(xì)胞