經(jīng)IFNγ基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞體外抗白血病作用的研究.pdf

1、1．觀察骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的體外生長特點，制備供轉(zhuǎn)染用的重組腺病毒載體AdGFP和AdIFN Y。 2．觀察腺病毒載體轉(zhuǎn)染對MSCs生長及對目的基因表達的影響，探討腺病毒載體對間充質(zhì)干細胞合適的轉(zhuǎn)染條件。 3．觀察轉(zhuǎn)IFN-γ基因的MSCs在體外對白血病K562細胞的抗白血病作用。方法： 1．體外對凍存的：MSCs細胞株復蘇后用含10％新生小牛血清的低糖DMEM：(L-DMEM)培養(yǎng)液進行培養(yǎng)擴增及傳代

2、，每天用胰酶消化后以細胞計數(shù)法繪制MSCs生長曲線；通過293細胞對實驗用的腺病毒載體AdGFP和AdIFN γ進行大量擴增和常規(guī)制備，以TCID<,50>法檢測腺病毒滴度。 2．以不同感染復數(shù)(MOI=50、100、200、500)的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs 4小時，采用MTT’法了解腺病毒載體轉(zhuǎn)染對MSCs增殖的影響；以綠色熒光蛋白(GFP)作為示蹤蛋白，應用熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察和檢測Ad-GFP轉(zhuǎn)染后不同時間GFP

3、的表達；以ELISA法檢測Ad-IFNγ轉(zhuǎn)染MSCs后第1、8、15、22、28天細胞上清IFNγ的分泌， 并與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染Ad-GFP的MSCs作比較。 3．將K562細胞與轉(zhuǎn)基因MSCs共培養(yǎng)，采用苔盼蘭計數(shù)法檢測轉(zhuǎn)IFN γ基因的MSCs對K562細胞增殖的影響；以DAPI染色觀察K562細胞凋亡形態(tài)；以流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因MSCs對K562細胞周期的影響。 結(jié)果： 1．體外培養(yǎng)成功地擴增出了數(shù)量較多

4、的MSCs，細胞生長曲線顯示MSCs細胞在體外有良好的生長特性，傳代培養(yǎng)細胞增殖迅速，在細胞生長對數(shù)期，MSCs的倍增時間約為28-36h。 2．通過293細胞的包裝和擴增成功制備出了大量的重組腺病毒載體：Ad-IFN Y和Ad-GFP，其滴度分別為：Ad-IFN Y 5.0×10<'8>U／ml：Ad-GFP1.0×10<'9>U／ml。 3．重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs在較低MOI值時(50和100)對細胞生長無明顯影

5、響(p>0.05)；當MOI值較高時(MOI≥200)腺病毒轉(zhuǎn)染則對MSCs的生長產(chǎn)生影響(p<0.05)，表現(xiàn)為經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞活性降低，增殖受抑，出現(xiàn)細胞病理現(xiàn)象。 4．選擇MOI=100的AdGFP轉(zhuǎn)染MSCs，于轉(zhuǎn)染后20h即可在熒光顯微鏡下見到GFP的表達，隨著時間推移GFP表達逐漸增加，到約2周后表達可以達到32％，隨后穩(wěn)定表達。當MOI增高后目的基因的表達可以相應增高，但是細胞病理現(xiàn)象明顯，細胞活性降低；當MOI=10

6、0時重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染對MSCs細胞周期無明顯影響(p>0.05)；含IFN-Y基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs分別可以于轉(zhuǎn)染后第1、8、15、22、28天在細胞培養(yǎng)上清中檢測到：IFN-Y的分泌，其分泌量隨著時間推移有下降趨勢；在各個時間點轉(zhuǎn)染AdGFP和未轉(zhuǎn)染的MSCs均不能在細胞上清中檢測到IFN-Y的分泌。 5．含IFN-Y基因重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染的MSCs對K562細胞的增殖有抑 制作用(p

7、-γ2000U／ml處理相似(p>0.05)；DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Ad-IFN v組及IFN-γ2000U/ml處理組凋亡細胞較未處理組增加；細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Ad-IFN γ組細胞Gl期增加，有絲分裂S期減少，凋亡細胞所占百分比增加。轉(zhuǎn)染Ad-GFP組則無此效應。 結(jié)論： 1.在適當?shù)臈l件下重組腺病毒載體可以有效地轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞。 2.轉(zhuǎn)基因MSCs細胞可以較穩(wěn)定和長期地表達目的基因，