慢病毒介導(dǎo)HO-1基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外缺血損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過慢病毒介導(dǎo)HO-1基因轉(zhuǎn)染豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，并建立體外模擬缺血性損傷模型，探討HO-1基因修飾對MSCs缺血性損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。從而為下一步HO-1基因修飾的MSCs移植治療心肌缺血的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：采用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、培養(yǎng)豬MSCs，并用免疫熒光法鑒定；用慢病毒包裝系統(tǒng)介導(dǎo)的HO-1基因轉(zhuǎn)染豬MSCs，通過熒光顯微鏡觀察并繪制轉(zhuǎn)染HO-1基因的MSCs(HO-1-MSC

2、s組)、未轉(zhuǎn)染HO-1基因的MSCs(MSCs組)生長曲線，觀察慢病毒轉(zhuǎn)染對MSCs增殖的影響。PCR檢測HO-1-MSCs組、MSCs組的HO-1mRNA表達(dá)；采用血清剝奪和缺氧(SOD)處理建立MSCs體外模擬缺血性損傷模型，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測評(píng)價(jià)HO-1-MSCs組、MSCs組在SOD后3h、6h及9h時(shí)的凋亡、死亡情況，并通過RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測兩組在SOD各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的HO-1mRNA及HO-1蛋白的表

3、達(dá)情況。
　　 結(jié)果：密度梯度離心結(jié)合貼壁法能有效分離、純化豬MSCs，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，可檢測到強(qiáng)熒光出現(xiàn)，免疫熒光染色顯示培養(yǎng)的細(xì)胞CD44、CD105表達(dá)陽性；細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制生長曲線結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因的MSCs與未轉(zhuǎn)基因的MSCs生長曲線沒有顯著差別，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HO-1-MSCs組較MSCs組在常氧培養(yǎng)條件下凋亡率(AR)(P>0.05)和死亡率(DR)沒有顯著差別(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組MSCs在各SOD時(shí)間

4、點(diǎn)的AR和DR較常氧培養(yǎng)條件下均顯著性增高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在同一SOD時(shí)間點(diǎn)，HO-1-MSCs組較MSCs組的AR顯著性降低(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR、Western blot結(jié)果顯示：在常氧培養(yǎng)條件下，HO-1-MSCs組較MSCs組的HO-1mRNA和HO-1蛋白表達(dá)均顯著增高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在各SOD時(shí)間點(diǎn)，兩組MSCs的HO-1mRNA和HO-1蛋白表達(dá)較常氧均顯著性增高(P<

5、0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著SOD時(shí)間延長，兩組MSCs的HO-1mRNA和蛋白表達(dá)均逐步增強(qiáng)；在同一SOD時(shí)間點(diǎn)，HO-1-MSCs組較MSCs組的HO-1mRNA和HO-1蛋白表達(dá)均顯著性增加(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.根據(jù)黏附特性可成功分離、培養(yǎng)獲得豬骨髓MSCs。
　　 2.按MOI=20，慢病毒包裝系統(tǒng)可成功將HO-1基因轉(zhuǎn)染MSCs：效率肯定、相對安全，且對MSCs的增