慢病毒介導(dǎo)的多藥耐藥基因體外轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及對(duì)其抗藥性的研究.pdf

1、惡性腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類生命健康的第一殺手，其治療方法種類繁多。其中，化療在防止復(fù)發(fā)、鞏固治療等方面起著不可替代的作用。然而，在長期反復(fù)的化療過程中常會(huì)由于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性和嚴(yán)重的骨髓抑制，造成治療的失敗。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，造成化療失敗原因與多藥耐藥（multid-rugresistancegene1,mdr1）基因及其編碼產(chǎn)物p-gp糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)有密切關(guān)系，這兩種物質(zhì)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)，具有

2、能量依賴的跨膜藥物外輸泵的功能，使胞內(nèi)藥物聚集濃度降低，而產(chǎn)生耐藥[1]。正常骨髓細(xì)胞低表達(dá)mdr1，因此對(duì)化療藥物敏感，使得其極易被化療藥物損傷，產(chǎn)生骨髓毒性，成為限制化療療效提高的重要原因。如能增強(qiáng)正常骨髓細(xì)胞中mdr1的表達(dá)，利用其耐藥特性，提高骨髓細(xì)胞的耐藥性，使大劑量化療能夠順利進(jìn)行，這對(duì)于惡性腫瘤的治療具有重要的意義。
　　干細(xì)胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。骨髓中存在兩種干細(xì)胞，造血干細(xì)胞（hae

3、mopoieticstemcells,HSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)，前者主要維持體內(nèi)的造血功能，后者具備向多種胚層組織細(xì)胞分化的能力。以往有研究將mdrl基因?qū)朐煅杉?xì)胞，試圖通過過表達(dá)的mdrl編碼產(chǎn)物p-gp使之產(chǎn)生抗腫瘤藥物能力，在高劑量藥物化療時(shí)，造血干細(xì)胞不受影響，而腫瘤細(xì)胞能夠最大限度被殺死，但是造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，限制了這一技術(shù)的發(fā)展；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（HumanB

4、oneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）由于具有：1、糾正或改善造血微環(huán)境的損傷，促進(jìn)移植后造血和免疫功能的重建；2、免疫調(diào)節(jié)功能；3、易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)；4、具有自我更新能力和多向分化潛能；5、易于分離培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)成為目前較理想的種子細(xì)胞，是細(xì)胞替代和基因治療理想的細(xì)胞來源。
　　基于上述認(rèn)識(shí)，本課題利用攜帶綠色熒光蛋白的含人mdr1全長的cDNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充干細(xì)胞，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)

5、胞對(duì)化療藥物的耐受能力。冀希為惡性血液病細(xì)胞治療和基因治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，為多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)帶來新的思路。
　　本研究主要分為三個(gè)部分
　　1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　目的：探討體外培養(yǎng)MSCs的方法和其生物學(xué)特性，為進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染奠定工作基礎(chǔ)。方法：密度梯度離心法及貼壁法分離MSCs,細(xì)胞生長至80％-100％融合時(shí)以1：2傳代,同時(shí)繪制生長曲線，F(xiàn)ACS進(jìn)行表面標(biāo)志物檢測(cè)，體外進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化。結(jié)果：

6、原代細(xì)胞培養(yǎng)18天長滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，經(jīng)過傳代后的細(xì)胞生長形態(tài)更均一、排列更為有序，提示細(xì)胞生長一代的周期及傳代過程對(duì)純化MSCs具一定作用。FACS測(cè)定表面標(biāo)志物測(cè)定提示，CD34、HLA-DR標(biāo)記陰性，分別為1.66％和1.19％；CD71、CD44為陽性，分別為77.79％和91.05％；體外成功定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。結(jié)論：人MSCs在體外條件下生長穩(wěn)定，多次傳代后FACS檢測(cè)標(biāo)志物仍有表達(dá)，定向分化能力穩(wěn)定，可作為穩(wěn)定的細(xì)胞來源基

7、礎(chǔ)。
　　2、攜帶綠色熒光標(biāo)記的慢病毒載體介導(dǎo)的mdr1基因修飾的人骨髓間充干細(xì)胞及其生物學(xué)特性的研究
　　目的：檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后目的基因的表達(dá)情況和生物學(xué)特性，為進(jìn)一步抗藥性研究奠定基礎(chǔ)。方法：攜帶綠色熒光標(biāo)記的含人mdr1全長的cDNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充干細(xì)胞，利用RT-PCR及WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后mdr1及p-gp在靶細(xì)胞的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染率的測(cè)定，羅丹明排泌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-gp

8、功能活性。結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率達(dá)83.44％,RT-PCR及WesternBlot證實(shí)外源性mdr1在靶細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，羅丹明排泌實(shí)驗(yàn)證明所表達(dá)的蛋白具有功能活性。結(jié)論：慢病毒載體可高效轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，外源基因可較好表達(dá)，細(xì)胞原有生物學(xué)特性不發(fā)生改變。
　　3、轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞耐藥性的測(cè)定
　　目的：測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的耐藥性是否得到顯著提高。方法：已轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入不同濃度不同種類的化療藥物，MTT法檢測(cè)吸光度值