慢病毒介導的多藥耐藥基因體外轉染人骨髓間充質干細胞及對其抗藥性的研究.pdf

1、惡性腫瘤是目前嚴重威脅人類生命健康的第一殺手，其治療方法種類繁多。其中，化療在防止復發(fā)、鞏固治療等方面起著不可替代的作用。然而，在長期反復的化療過程中常會由于腫瘤細胞產生耐藥性和嚴重的骨髓抑制，造成治療的失敗。大量實驗研究證實，造成化療失敗原因與多藥耐藥（multid-rugresistancegene1,mdr1）基因及其編碼產物p-gp糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)有密切關系，這兩種物質在腫瘤細胞內高水平表達，具有

2、能量依賴的跨膜藥物外輸泵的功能，使胞內藥物聚集濃度降低，而產生耐藥[1]。正常骨髓細胞低表達mdr1，因此對化療藥物敏感，使得其極易被化療藥物損傷，產生骨髓毒性，成為限制化療療效提高的重要原因。如能增強正常骨髓細胞中mdr1的表達，利用其耐藥特性，提高骨髓細胞的耐藥性，使大劑量化療能夠順利進行，這對于惡性腫瘤的治療具有重要的意義。
　　干細胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體。骨髓中存在兩種干細胞，造血干細胞（hae

3、mopoieticstemcells,HSCs）和間充質干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)，前者主要維持體內的造血功能，后者具備向多種胚層組織細胞分化的能力。以往有研究將mdrl基因導入造血干細胞，試圖通過過表達的mdrl編碼產物p-gp使之產生抗腫瘤藥物能力，在高劑量藥物化療時，造血干細胞不受影響，而腫瘤細胞能夠最大限度被殺死，但是造血干細胞轉染效率較低，限制了這一技術的發(fā)展；人骨髓間充質干細胞（HumanB

4、oneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）由于具有：1、糾正或改善造血微環(huán)境的損傷，促進移植后造血和免疫功能的重建；2、免疫調節(jié)功能；3、易于外源基因的轉染和表達；4、具有自我更新能力和多向分化潛能；5、易于分離培養(yǎng)等優(yōu)點成為目前較理想的種子細胞，是細胞替代和基因治療理想的細胞來源。
　　基于上述認識，本課題利用攜帶綠色熒光蛋白的含人mdr1全長的cDNA慢病毒載體轉染人骨髓間充干細胞，并檢測轉染后細

5、胞對化療藥物的耐受能力。冀希為惡性血液病細胞治療和基因治療提供實驗和理論依據，為多藥耐藥的逆轉帶來新的思路。
　　本研究主要分為三個部分
　　1、骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)
　　目的：探討體外培養(yǎng)MSCs的方法和其生物學特性，為進一步進行細胞轉染奠定工作基礎。方法：密度梯度離心法及貼壁法分離MSCs,細胞生長至80％-100％融合時以1：2傳代,同時繪制生長曲線，F(xiàn)ACS進行表面標志物檢測，體外進行定向誘導分化。結果：

6、原代細胞培養(yǎng)18天長滿整個培養(yǎng)瓶，經過傳代后的細胞生長形態(tài)更均一、排列更為有序，提示細胞生長一代的周期及傳代過程對純化MSCs具一定作用。FACS測定表面標志物測定提示，CD34、HLA-DR標記陰性，分別為1.66％和1.19％；CD71、CD44為陽性，分別為77.79％和91.05％；體外成功定向誘導分化為脂肪細胞。結論：人MSCs在體外條件下生長穩(wěn)定，多次傳代后FACS檢測標志物仍有表達，定向分化能力穩(wěn)定，可作為穩(wěn)定的細胞來源基

7、礎。
　　2、攜帶綠色熒光標記的慢病毒載體介導的mdr1基因修飾的人骨髓間充干細胞及其生物學特性的研究
　　目的：檢測人骨髓間充質干細胞經轉染后目的基因的表達情況和生物學特性，為進一步抗藥性研究奠定基礎。方法：攜帶綠色熒光標記的含人mdr1全長的cDNA慢病毒載體轉染人骨髓間充干細胞，利用RT-PCR及WesternBlot檢測轉染后mdr1及p-gp在靶細胞的表達情況，流式細胞儀進行轉染率的測定，羅丹明排泌實驗檢測p-gp

8、功能活性。結果：流式細胞儀檢測轉染率達83.44％,RT-PCR及WesternBlot證實外源性mdr1在靶細胞內有表達，羅丹明排泌實驗證明所表達的蛋白具有功能活性。結論：慢病毒載體可高效轉染人骨髓間充質干細胞，外源基因可較好表達，細胞原有生物學特性不發(fā)生改變。
　　3、轉基因骨髓間充質干細胞耐藥性的測定
　　目的：測定轉染后細胞的耐藥性是否得到顯著提高。方法：已轉染細胞加入不同濃度不同種類的化療藥物，MTT法檢測吸光度值