BMP2和EGFP重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:1.本實驗為建立一套行之有效的體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的方法。2.通過腺病毒介導(dǎo)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2)和EGFP基因轉(zhuǎn)染兔BMSCs后，通過行Westenblot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色以觀察BMP2和EGFP的表達(dá)情況。
　　方法:1.用骨穿針抽取兔股骨粗隆處的骨髓，通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁法，分離、培養(yǎng)兔BMSCs并觀察細(xì)胞生長情況。2.使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含地塞米松10-8mol/L、維生素C5

2、0mg/L、β-磷酸甘油10mmol/L、體積分?jǐn)?shù)為15％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液），在誘導(dǎo)后第7天、14天分別檢測Ⅰ型膠原及堿性磷酸酶(ALP)，成骨誘導(dǎo)后第3周行鈣結(jié)節(jié)檢測;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和表面標(biāo)記。3.轉(zhuǎn)染后，通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色及蛋白印跡檢測外源基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.分離出大量具有活性的兔BMSCs。接種48小時后觀察，細(xì)胞貼壁形態(tài)均表現(xiàn)為長梭形，呈渦旋狀、放射狀排列。一般4～5d左右可長滿培養(yǎng)瓶底壁。2

3、.兔BMSCs細(xì)胞周期約有56.84％處于G1期;CD44表達(dá)陽性，CD45表達(dá)陰性;經(jīng)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后，Ⅰ型膠原免疫組化染色顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞胞質(zhì)呈陽性表達(dá)表現(xiàn)為棕黃色，正常組胞質(zhì)陰性表達(dá)。ALP酶標(biāo)法顯示誘導(dǎo)組呈陽性表達(dá)，其含量較正常組明顯增加。實驗組誘導(dǎo)組茜素紅染色呈陽性，正常組未染色。3.轉(zhuǎn)染48h后，通過免疫組化檢測結(jié)果示兔BMSCs細(xì)胞胞漿可見棕黃色染色，呈陽性表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈陰性。分別提取轉(zhuǎn)染48h后及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞蛋白，We