腺病毒介導BMP-2基因轉(zhuǎn)染誘導性多能間充質(zhì)干細胞成骨方向的研究.pdf

1、背景和目的：
　　各種原因造成的骨組織缺損是臨床常見疾患，隨著骨組織工程技術(shù)的興起，給傳統(tǒng)治療難點的骨缺損帶來了一些曙光，組織工程利用自體細胞的生物活性，給予外在因素特定的干擾下將其誘導分化為所需的細胞，從而達到修復(fù)組織的能力。傳統(tǒng)的間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞已在體外成功被誘導定向分化，但涉及到一些倫理、取材限制等問題，因此其在組織學上作為種子方面的研究受到一定的限制；而隨著體內(nèi)體細胞的研究，通過使用幾個特定的轉(zhuǎn)錄因子誘導體細胞的重

2、編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的出現(xiàn)，可作為組織學中理想的種子細胞，本課題在前期已成功將人、山羊、大鼠成纖維細胞誘導為 iPSCs的基礎(chǔ)上，運用誘導因子將山羊 iPSCs定向分化為iPSCs-MSC，作為骨組織工程的優(yōu)化種子細胞，然后利用體外構(gòu)建腺病毒搭載生物因子BMP-2，從而去轉(zhuǎn)染誘導iPSCs-MSC，探討載體介導下種子細

3、胞轉(zhuǎn)染的可行性，同時觀察研究iPSCs-MSC在生物因子BMP-2的作用下，對其體外增殖和分化成骨能力的影響。
　　方法：
　　1.體外擴增預(yù)先構(gòu)建好的iPSCs-MSC，取傳代至第三代的iPSCs-MSC，按照普通培養(yǎng)基、含BMP-2的培養(yǎng)基、腺病毒-BMP-2的培養(yǎng)基對其進行體外繁殖，而分別設(shè)定為空白對照組、陰性對照組和實驗組，然后分別往各組加入成骨誘導液，在體外進行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d用CCK-

4、8試劑檢測iPSCs-MSC的存活及增殖活性；
　　2.三組處理好的細胞，轉(zhuǎn)染后，分別于3、7、14天后終止培養(yǎng)，利用堿性磷酸酶試劑盒檢測其堿性磷酸酶表達情況；
　　3.然后在三組細胞培養(yǎng)增殖至20天后，使用茜素紅染液，然后分別于染色后1周、2周后用光學顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成；
　　4.使用 Western Blotting法測定三組細胞，檢測轉(zhuǎn)染后BMP-2的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8

5、檢測后，實驗組細胞的可見光吸收度 OD高于另外兩項對照組，說明實驗組中細胞增殖能力活性明顯強于另外兩組；
　　2.腺病毒轉(zhuǎn)染后的三組細胞ALP測定呈陽性反應(yīng)，且細胞內(nèi)ALP活性隨著時間的延長而增加，但是實驗組中ALP含量明顯高于另外兩組，同時隨著時間延長，陰性對照組較空白對照組也表現(xiàn)出強ALP表達能力；
　　3.實驗組紅色礦化結(jié)節(jié)含量明顯，陰性對照組礦化結(jié)節(jié)表達稍高于空白對照組，空白對照組未見明顯紅色結(jié)節(jié)；
　　4.各

6、組細胞轉(zhuǎn)染后，實驗組細胞BMP-2表達明顯高于陰性對照組，陰性對照組表達不明顯，空白對照組未見表達。
　　結(jié)論：
　　1．證實了iPSC-MSCs在體外成骨的可行性；
　　2.說明了體外生物因子BMP-2具有能顯著促進iPSC-MSCs向成骨細胞的分化和功能；
　　3．腺病毒能明顯加快體外BMP-2對iPSC-MSCs向成骨細胞的分化速率；
　　4．BMP-2基因轉(zhuǎn)染誘導性多能間充質(zhì)干細胞后在體外可明顯促進