慢病毒介導(dǎo)hHCN4基因體外轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建生物起搏器的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景： 在過(guò)去的70年中，電子起搏器在心臟傳導(dǎo)阻滯性疾病(病竇綜合征、房室傳導(dǎo)阻滯等)及頑固性心力衰竭、心室顫動(dòng)等的治療方面拯救了大量患者的生命。但是它也逐漸暴露出一些缺點(diǎn)：電池壽命有限(8～10年)、非生理性順序激動(dòng)、一些難以避免的并發(fā)癥(感染、出血、心肌穿孔、電極脫位)等等。從心臟的生理功能和人體適應(yīng)性的角度，理想的起搏器應(yīng)該是“生物起搏器”?，F(xiàn)有的生物起搏方法主要包括基因生物起搏及細(xì)胞生物起搏。前者主要集中在3個(gè)基因治

2、療策略上：①上調(diào)心肌細(xì)胞膜上的β2腎上腺素能受體表達(dá)；②抑制Kir2基因家族編碼內(nèi)向整流電流Ik1通道；③上調(diào)心肌細(xì)胞起搏電流的α(HCN2)和β(MiRP1)亞單位基因。但目前這些研究尚未取得突破性進(jìn)展，且上述生物起搏靶基因也不是竇房結(jié)細(xì)胞自動(dòng)去極化的特異性調(diào)控基因。 大量研究表明，由超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道基因超家族編碼的起搏電流(If)，在竇房結(jié)起搏細(xì)胞舒張期自動(dòng)除極化過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。If通道家族共有4個(gè)成

3、員，即HCN1～HCN4，其中HCN4在竇房結(jié)中表達(dá)最高，是調(diào)控If電流及維持竇房結(jié)起搏細(xì)胞電生理功能的特異性基因，是一種理想的生物起搏靶基因。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有多向分化潛能及其對(duì)外源基因的高轉(zhuǎn)染效率和高效穩(wěn)定表達(dá)，不少學(xué)者利用MSCs的上述特性將其作為基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞平臺(tái)，導(dǎo)入目的片段基因，把細(xì)胞工程和基因治療進(jìn)行有機(jī)結(jié)合。例如，將mHCN2轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MSCs能產(chǎn)生高水平的類似If的電流；將轉(zhuǎn)染了mHCN

4、2起搏基因的MSCs進(jìn)行體內(nèi)移植，可明顯提高心室的“自律性”。但是HCN2亞型的生理功能在于穩(wěn)定靜息狀態(tài)下起搏細(xì)胞的舒張期膜電位，從而起到穩(wěn)定起搏節(jié)律的作用，而對(duì)于運(yùn)動(dòng)和交感刺激狀態(tài)下的節(jié)律穩(wěn)定性則無(wú)明顯影響；而HCN4不僅對(duì)產(chǎn)生正常起搏電位和基礎(chǔ)心率至關(guān)重要，而且也參與交感神經(jīng)對(duì)心率的調(diào)節(jié)作用。 研究目的： 我們?cè)O(shè)想以hHCN4為生物起搏的靶基因，應(yīng)用豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為細(xì)胞生物起搏的平臺(tái)，通過(guò)慢病毒載體

5、轉(zhuǎn)染以獲取穩(wěn)定高表達(dá)hHCN4基因的MSCs，并對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的起搏通道蛋白的表達(dá)及If電流動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)，為建立新型有效的細(xì)胞生物起搏治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法： 1.豬間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與純化 采用密度梯度離心法分離純化豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)采用直接貼壁法培養(yǎng)；用倒置顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞形態(tài)學(xué)的動(dòng)態(tài)觀察。 2.慢病毒hHCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs hHCN4慢病毒載體(Lentiv-EGFP-h

6、HCN4)和不含hHCN4的慢病毒對(duì)照載體(Lentiv-EGFP)對(duì)第2代MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染。熒光顯微鏡觀察綠色免疫熒光蛋白表達(dá)情況；免疫組化染色檢測(cè)hHCN4蛋白表達(dá)情況； 3.Western blot印跡檢測(cè)hHCN4轉(zhuǎn)染MSCs各組的hHCN4通道蛋白表達(dá)情況； 4.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)重組hHCN4通道進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)定。 研究結(jié)果： 1.倒置顯微鏡可見，經(jīng)原代培養(yǎng)的MSCs多數(shù)為成纖維樣的梭形細(xì)胞，呈

7、克隆樣生長(zhǎng)； 2.成功將hHCN4慢病毒載體(Lentiv-EGFP-hHCN4)和不含hHCN4的慢病毒對(duì)照載體(Lentiv-EGFP)轉(zhuǎn)染至豬MSCs，獲得了穩(wěn)定表達(dá)hHCN4基因的MSCs。 3.熒光顯微鏡可見，兩組綠色熒光蛋白表達(dá)及分布無(wú)明顯差異，轉(zhuǎn)染效率約為40～50％。 4.轉(zhuǎn)染后免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見，hHCN4組細(xì)胞hHCN4抗體染色為陽(yáng)性，GFP組及對(duì)照組細(xì)胞則呈弱陽(yáng)性； 5.Weste

8、rn blot印跡檢測(cè)可見hHCN4組有一條約150kDa的條帶，而GFP組及對(duì)照組條帶不明顯； 6.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄到IHCN4，得到電流密度-電壓曲線，其激活電壓約為-75mV，此電流可以被4mmol/L CsCl阻斷。GFP組和對(duì)照組的MSCs細(xì)胞均無(wú)IHCN4。 結(jié)論： 1.密度梯度離心法可以成功分離純化豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.以hHCN4作為生物起搏的靶基因，通過(guò)慢病毒載體可以成功轉(zhuǎn)染MS