HCN2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建生物起搏器的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)律性活動(dòng)均依賴于一種能產(chǎn)生起搏電流的細(xì)胞,其起搏活動(dòng)特點(diǎn)是存在起搏電流If。進(jìn)來(lái)的研究證實(shí)If在調(diào)控心臟和神經(jīng)元的自發(fā)搏動(dòng)中起著非常重要的作用,在目前以基因治療和細(xì)胞移植技術(shù)治療緩慢型心律失常疾病的研究中,If離子通道基因(HCN)備受重視。本課題采用HCN2重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,構(gòu)建具有自動(dòng)起搏功能的生物起搏器。 方法： 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和

2、鑒定： 采用Pereoll密度梯度分離和貼壁相結(jié)合的方法分離pBMSCs后,培養(yǎng)于含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基,并傳代培養(yǎng)；觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；通過CD34、CD44、CD45、CD71、VⅢ因子及desmin的免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞成份鑒定。應(yīng)用VEGF體外誘導(dǎo),觀察pBMSCs的多向分化的功能特性。 2、重組腺病毒載體Ad.HCN2的構(gòu)建及其檢測(cè)： 應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法制備Ad.HCN2重

3、組腺病毒,將鑒定正確的重組腺病毒進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定。用HeLa細(xì)胞檢測(cè)是否有野生型腺病毒產(chǎn)生；以GFP為信號(hào)基因,確定最佳MOI;繪制Ad.GFP轉(zhuǎn)染pBMSCs表達(dá)強(qiáng)度的時(shí)間曲線；流式細(xì)胞檢測(cè)Ad.HCN2轉(zhuǎn)染pBMSCs的細(xì)胞活力及細(xì)胞周期的變化；繪制Ad.HCN2、Ad.Null分別轉(zhuǎn)染pBMSCs以及未轉(zhuǎn)染的pBMSCs的生長(zhǎng)曲線。 3、重組腺病毒Ad.HCN2轉(zhuǎn)染pBMSCs構(gòu)建生物起搏器的功能鑒定： 以

4、Ad.HCN2轉(zhuǎn)染pBMSCs作為實(shí)驗(yàn)組,Ad.Null轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照組,未轉(zhuǎn)染pBMSCs作為空白對(duì)照組。用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)、免疫熒光染色染色、流式細(xì)胞技術(shù)、免疫印跡雜交、膜片鉗分別檢測(cè)各組的HCN2的mRNA、通道蛋白的表達(dá)以及HCN2通道的電生理學(xué)特性；將各組細(xì)胞與乳鼠心肌細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)后,觀察乳鼠心肌細(xì)胞收縮頻率變化。 結(jié)果： 1、pBMSCs的形態(tài)、表面標(biāo)記、生長(zhǎng)曲線及多向分化潛能經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)檢

5、測(cè),顯示所培養(yǎng)細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài),免疫化學(xué)染色CD44、CD71陽(yáng)性,CD34、CD45陰性、desmin、VⅢ因子免疫組織化學(xué)陰性,符合pBMSCs的形態(tài)和表面標(biāo)記；流式細(xì)胞儀分析,CD44、CD71陽(yáng)性細(xì)胞分別占76.27％、85.36％,體外經(jīng)VEGF誘導(dǎo)后,免疫組織化學(xué)鑒定pBMSCs的CD34表面標(biāo)記轉(zhuǎn)為陽(yáng)性,說明pBMSCs向內(nèi)皮系分化,其具有多向分化能力。 2、重組腺病毒Ad.HCN2的構(gòu)建成功制備Ad.HCN

6、2重組腺病毒經(jīng)濃縮、純化,用HeLa細(xì)胞檢測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)有野生型腺病毒產(chǎn)生。以Ad.GFP轉(zhuǎn)染pBMSCs確定MOI=50為最佳感染復(fù)數(shù)；Ad.GFP轉(zhuǎn)染pBMSCs后的表達(dá)強(qiáng)度至一周后下降,可持續(xù)表達(dá)1月以上：轉(zhuǎn)染Ad.HCN2對(duì)pBMSCs的細(xì)胞活力和細(xì)胞周期無(wú)明顯變化；Ad.HCN2、.Ad.Null轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的pBMSCs的生長(zhǎng)曲線比較無(wú)明顯差異。 3、生物起搏器的功能鑒定逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)提示實(shí)驗(yàn)組HCN2mRNA水

7、平高于對(duì)照組。免疫熒光染色檢測(cè)可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜染色,流式細(xì)胞技術(shù),免疫印跡雜交均提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞有HCN2蛋白的表達(dá),而對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。轉(zhuǎn)染HCN2的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞電生理學(xué)特點(diǎn)：給予超極化刺激時(shí),實(shí)驗(yàn)組可記錄到超極化激活的內(nèi)向電流即If,其激活電位約為-60mY,完全激活電位-140mV,呈電壓依賴性。細(xì)胞外給予低濃度的Cs+(4mmol/L),內(nèi)向的If被明顯抑制。對(duì)照組未見If電流。在實(shí)驗(yàn)組與乳鼠心肌細(xì)胞(NRCs)聯(lián)合培養(yǎng)后可見

8、NRCs收縮,培養(yǎng)液中滴入異丙腎上腺素可見細(xì)胞收縮頻率增快,陰性及空白對(duì)照組中無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。 結(jié)論： 1、采用Percoll密度梯度和貼壁相結(jié)合的方法,可分離獲得較高純度的pBMSCs。pBMSCs體外增殖速度快,可短期內(nèi)達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要細(xì)胞數(shù)量。 2、Ad.HCN2可以安全、有效的轉(zhuǎn)染pBMSCs構(gòu)建生物起搏器,其表達(dá)強(qiáng)度隨細(xì)胞增殖略有下降。以腺病毒為載體進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)染對(duì)pBMSCs生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。 3、實(shí)