Shox2基因轉(zhuǎn)染犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)與功能檢測(cè).pdf

1、背景和目的:
　　病竇綜合征(sick sinus syndrome)是一種常見的嚴(yán)重威脅患者生命的緩慢性心律失常，臨床無特效藥物可以根治，主要治療手段是植入人工電子起搏器。雖然電子起搏器的植入能有效改善癥狀、挽救患者生命，但仍存在許多問題:如應(yīng)激狀態(tài)下缺乏有效的生物反應(yīng)性、電池使用時(shí)間有限、異物植入、外周電磁場(chǎng)干擾等。因此，當(dāng)前心臟電生理領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)就是構(gòu)建一種具有自主搏動(dòng)能力的“生物心臟起搏器”，以取代電子起搏器。

2、>　　超極化啟動(dòng)的環(huán)核苷酸門控通道(HCN)的基因亞型HCN4及其介導(dǎo)的起搏離子流(If)是竇房結(jié)細(xì)胞4期自動(dòng)去極化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往研究表明，圍繞HCN基因開展的重建生物起搏點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法，都存在著移植后起搏功能退化或消失的現(xiàn)象。由此可見，僅僅重建If的離子通道無法
　　形成持久有效的生物起搏點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)參與胚胎心臟早期發(fā)育的矮小同源盒基因亞型2(Shox2)能夠顯著抑制Nkx2.5并有效上調(diào)HCN4的表達(dá)，是調(diào)控胚胎心臟細(xì)胞

3、向竇房結(jié)細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。因此，利用Shox2作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向竇房結(jié)樣細(xì)胞分化，是生物起搏研究的一種理想選擇。本研究在國家自然科學(xué)基金(81270246)資助下，將構(gòu)建好的攜帶mShox2基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)后進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，運(yùn)用WB和膜片鉗等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)Shox2-MSCs進(jìn)行相關(guān)的生理生化檢查，以期探討過表達(dá)Shox2基因的cMSCs作為一種生物起搏的“種子細(xì)胞”的可行性。
　　研

4、究方法:
　　1.選取健康成年犬一只，麻醉后抽取骨髓，密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)cMSCs，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，流式細(xì)胞儀鑒定。
　　2.根據(jù)NCBI小鼠Shox2 mRNA序列構(gòu)建包裝慢病毒載體pLentis-mShox2-RFP及pLentis-RFP，載體內(nèi)攜帶嘌呤霉素抗藥基因用于細(xì)胞純化。
　　3.利用構(gòu)建好的兩種慢病毒載體轉(zhuǎn)染cMSCs，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與心肌細(xì)胞(CMs)

5、，再利用嘌呤霉素純化誘導(dǎo)后的cMSCs。
　　4.利用WB、實(shí)時(shí)定量PCR和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Cx43/45、HCN4、Tbx3、Nkx2.5等心肌細(xì)胞特異性基因的表達(dá)情況。
　　5.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)分化后Shox2-cMSCs和對(duì)照組的離子流通道動(dòng)力學(xué)特征。
　　結(jié)果:
　　1.采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)cMSCs，第3代可得到純化的呈典型多邊形或長梭形的細(xì)胞，胞體飽滿，折光性好，具有

6、良好的增殖能力和誘導(dǎo)分化潛能。流式細(xì)胞儀篩查，CD44和CD29高表達(dá)（93.2±3.6％），不表達(dá)CD34和CD45，符合MSCs特性。
　　2.在轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI=20的情況下，72 h后熒光顯微鏡下觀察慢病毒對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到（85±4.5）％(n=5）。慢病毒轉(zhuǎn)染能力好，細(xì)胞生長活性未見明顯改變。
　　3.取轉(zhuǎn)染陽性的cMSCs行體外誘導(dǎo)分化后分為4組:A組(RFP-cMSCs組)、B組(RFP-cMSCs+

7、CMs共培養(yǎng)組)、C組(Shox2-RFP-cMSCs組)、D組(Shox2-RFP-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組)。
　　4.Shox2-RFP-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組細(xì)胞經(jīng)過共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)特異性基因HCN4、Cx45、Tbx3的表達(dá)較其他組明顯增加(P＜0.05)，而RFP-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組細(xì)胞的Nkx2.5及Cx43的表達(dá)與其他三組相比明顯增加。
　　5.全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示，Shox2-RF

8、P-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組細(xì)胞可以記錄到超極化啟動(dòng)的內(nèi)向電流，該電流具有明顯的時(shí)間及電壓依賴特性，且對(duì)Cs+敏感。根據(jù)記錄到的尾電流重建該內(nèi)向電流啟動(dòng)曲線和翻轉(zhuǎn)電位，并進(jìn)行計(jì)算，得到半數(shù)最大激活電壓為-89.4±3.7mV，斜率為-16.3±1.5，翻轉(zhuǎn)電位是-28.9±6.7mV。而僅轉(zhuǎn)染RFP的RFP-cMSCs組和RFP-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組細(xì)胞，未能記錄到超極化啟動(dòng)的內(nèi)向電流。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用密度

9、梯度離心結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)法，早期就可以得到純化的MSCs，具有良好的增殖活性和多向分化潛能。
　　2.構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，Shox2-MSCs組細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Shox2蛋白，有功能性HCN4通道出現(xiàn)。僅轉(zhuǎn)染RFP的MSCs未能檢測(cè)到HCN4蛋白。
　　3.Shox2-MSCs與CMs共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后，高表達(dá)Cx45、Tbx3及HCN4，符合心臟傳導(dǎo)組織的表達(dá)特征。對(duì)照組細(xì)胞高表達(dá)Cx43、Nkx2.5，與工作心肌細(xì)胞