HCN4和Cx45基因?qū)腴g充質(zhì)干細胞構(gòu)建起搏細胞的實驗研究.pdf

1、目的:利用慢病毒載體將小鼠超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道4(mHCN4)基因和小鼠連接子蛋白45(mCx45)基因?qū)氪笫蠊撬栝g充質(zhì)干細胞(rMSC)，構(gòu)建生物起搏細胞。
　　方法:
　　1、從GeneBank查詢目的基因mHCN4、mCx45序列，化學合成cDNA并PCR擴增，同源重組到pLenti-CMV-EGFP/RFP的EcoRⅠ位點，得到pLenti-CMV-HCN4-RFP、pLenti-CMV-Cx45-EG

2、FP重組慢病毒質(zhì)粒，用過四質(zhì)粒系統(tǒng)導入293T細胞包裝慢病毒，熒光實時定量PCR法測定重組慢病毒和對照慢病毒pLenti-CMV-EGFP液的滴度。
　　2、采用骨髓腔沖洗法分離SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞。采用胰酶消化法分離新生大鼠心肌細胞，差速貼壁法去除成纖維細胞，每日觀察其搏動情況。
　　3、用攜帶HCN4-RFP的慢病毒轉(zhuǎn)染rMSC作為實驗組，用攜帶EGFP的對照慢病毒轉(zhuǎn)染rMSC作為對照組，轉(zhuǎn)染72小時后熒光顯微鏡下

3、觀察熒光表達情況，并行流式細胞學檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率。利用電壓鉗記錄陽性轉(zhuǎn)染細胞的起搏電流If。將實驗組(mHCN4-rMSC)和對照組(null-rMSC)分別與NRVM共培養(yǎng)，隔天記錄各組NRVM(n=6)的搏動頻率。
　　4、用攜帶Cx45-EGFP的慢病毒轉(zhuǎn)染HCN4-rMSC，將共表達HCN4和C×45的rMSC作為實驗組，對照組為HCN4-rMSC，轉(zhuǎn)染72小時后熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，并行流式細胞學檢測慢病毒轉(zhuǎn)染

4、效率。將實驗組（mHCN4-Cx45-rMSC）和對照組(mHCN4-rMSC)分別與NRVM共培養(yǎng)，隔天記錄各組NRVM(n=6)的搏動頻率。
　　結(jié)果:
　　1、mHCN4和mCx45基因分別成功重組到到pLenti-CMV-RFP和pLenti-CMV-EGFP質(zhì)粒中，通過四質(zhì)粒系統(tǒng)成功包裝出重組慢病毒pLenti-CMV-HCN4-RFP和pLenti-CMV-Cx45-EGFP，熒光實時定量PCR法測定慢病毒液的滴

5、度分別為2.2×108TU/ml、1.93×108TU/ml，對照慢病毒pLenti-CMV-EGFP的滴度為1.89×109TU/ml。
　　2、分離培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)傳代后純度不斷提升，第3代時細胞形態(tài)、大小基本相同，呈簇狀聚集，純度達到90％左右。分離的新生大鼠心室肌細胞接種前臺盼藍染色提示大約80％存活，培養(yǎng)至第3天時80％左右的心肌細胞出現(xiàn)自發(fā)性收縮，頻率在60次/分左右;培養(yǎng)至第10天后心肌細胞搏動頻率逐漸減

6、慢，至第14天基本停止搏動。
　　3、慢病毒轉(zhuǎn)染72小時后熒光顯微鏡下觀察到實驗組(HCN4-RFP)表達片狀紅色熒光，對照組(null-EGFP)表達片狀綠色熒光，流式細胞學熒光檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率實驗組為（57.1±2.3）％，對照組為（62.3±2.1）％。實驗組用電壓鉗記錄到高水平電壓-時間依從的超極化激活的內(nèi)向性起搏電流If，If通道激活的超極化電位為-80mV，而對照組未記錄到起搏電流。將rMSC與NRVM共培養(yǎng)4天后，

7、實驗組共培養(yǎng)NRVM的搏動頻率76±4次/分顯著高于對照組的62±2次/分。
　　4、慢病毒轉(zhuǎn)染72小時后熒光顯微鏡下觀察到實驗組(HCN4-RFP+Cx45-EGFP)同時表達片狀紅色熒光和點狀綠色熒光，對照組（HCN4-RFP）表達片狀紅色熒光。流式細胞學熒光檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率實驗組為（58.4±1.1）％，對照組為（57.1±2.3）％。將rMSC與NRVM共培養(yǎng)4天后，實驗組共培養(yǎng)NRVM的搏動頻率93±4次/分顯著高于對