急性心肌梗死經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細胞移植前后Cx43、Cx45與心電生理變化的實驗研究.pdf

1、目的：⑴從新生大鼠的骨髓中分離出MSCs，進行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和鑒定，探討MSCs向心肌細胞定向分化的潛能，為MSCs移植治療MI奠定基礎(chǔ)。⑵建立穩(wěn)定的MI大鼠模型，MSCs體外標(biāo)記后移植，觀察MI大鼠經(jīng)MSCs移植后左室功能和病理的變化。⑶探討MSCs移植對AMI后心電生理的影響，為進一步研究MSCs移植與心律失常的關(guān)系建立基礎(chǔ)。⑷探討經(jīng)5-aza體外誘導(dǎo)后的MSCs移植對MI后Cx43/Cx45重構(gòu)的影響及其與心律失常的關(guān)系。

2、 方法：①抽取Wistar大鼠骨髓液，采用密度為1.073的percoll細胞分離液，通過密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，利用細胞貼壁篩選法純化MSCs；以含10％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培養(yǎng)基添加青霉素和鏈霉素于37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2孵箱中培養(yǎng)，以10μmol/L的5-溴脫氧尿核苷(5-aza)進行體外誘導(dǎo)成心肌樣細胞并進行α-肌動蛋白(α-actin)、心肌特異性肌鈣蛋白T(cTnT)和縫隙連接蛋白43(Cx

3、43)免疫組化鑒定，同時行透射電鏡觀察肌絲等細胞超微結(jié)構(gòu)。②Wistar大鼠隨機分為4組，正常對照組(Nor組)、假手術(shù)組(Sham組)、心肌梗死+生理鹽水組(MI組)和MSCs移植組(MSCs組)，每組45只。提前抽取同種異體大鼠骨髓，體外擴增MSCs達1×107，加入10μmol/L的5-aza誘導(dǎo)成心肌樣細胞，進行長期傳代和培養(yǎng)。③Wistar大鼠隨機分為4組，正常對照組(Nor組)、假手術(shù)組(Sham組)、心肌梗死+生理鹽水組(

4、MI組)和MSCs移植組(MSCs組)，每組45只。開胸后在心外膜相應(yīng)區(qū)域置入1對魚鉤狀電極，電極連接心臟電生理刺激儀，心電圖機記錄標(biāo)準(zhǔn)2導(dǎo)聯(lián)心電圖。行4:1的S1S2負(fù)向掃描法測定VERP；行間斷S1S1刺激法測定VET；同時觀察并記錄程序刺激過程中所誘發(fā)的室性心動過速(室速)的數(shù)量和類型。 結(jié)果：⑴MSCs通過密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法分離后，在含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中生長良好。體外培養(yǎng)24小時后即可貼壁生長，7

5、～10天細胞迅速增殖，10～12天基本鋪滿瓶底。傳代后MSCs分布較均勻，呈扁平多角形、三角形和梭形等多種形態(tài)，排列密集。經(jīng)10μmol/L的5-aza誘導(dǎo)4周后，MSCs可分化為形態(tài)均一的長梭形心肌樣細胞，排列方向趨于一致，偶可見自發(fā)搏動的細胞，搏動頻率10～20次/分，行免疫組化染色示α-actin、cTnT和Cx43陽性表達。電鏡觀察示誘導(dǎo)后橫紋樣結(jié)構(gòu)形成，胞質(zhì)中有富集的糖原顆粒及肌絲形成。⑵采用開胸結(jié)扎LAD的方法可有效建立大鼠

6、AMI模型，MI組和MSCs組大鼠7天存活率為87.8％。行二次開胸細胞移植術(shù)，MI組總存活率為68.9％，MSCs組總存活率為80.0％。MSCs移植前DAPI的標(biāo)記率達100％；心臟彩超結(jié)果示，MI組干預(yù)后各周的LVIDd和LNIDs顯著增加，EF和FS則顯著下降；與MI組相比，MSCs組干預(yù)后各周的LVIDs減小，EF和FS則顯著增加。隨著干預(yù)時間的延長，MI組和MSCs組的LVIDd和LVIDs均持續(xù)增加，而EF和FS則持續(xù)下降

7、。⑶與Sham組相比，MI組各周ECG的PR間期、QRS時限、QT間期及QTc間期等均明顯延長，VERP增加，VFT減小。與MI組相比，MSCs組干預(yù)后各周的PR間期、QRS時限和VERP縮短而VFT增加。不同周數(shù)間的比較，隨著干預(yù)時間的延長，MI組和MSCs組的ECG各參數(shù)以及VERP和VFT均無統(tǒng)計學(xué)差異。⑷ISCM觀察可見DAPI標(biāo)記帶藍色熒光的移植MSCs細胞核，呈小島樣分布且較廣泛，隨著移植時間的延長熒光強度逐漸減弱。同一切片

8、的多通道的激發(fā)光觀察發(fā)現(xiàn)移植的MSCs可表達Cx43。 結(jié)論：①MSCs體外易于分離、純化和長期培養(yǎng)。誘導(dǎo)可分化為自發(fā)搏動的心肌樣細胞，表達α-actin、cTnT和Cx43并形成肌絲結(jié)構(gòu)。說明MSCs具有較強的自我增殖能力和多向分化潛能，可作為移植治療MI的理想的細胞來源。②采用開胸結(jié)扎LAD的方法可建立穩(wěn)定的AMI大鼠模型。同種異體MSCs移植可在宿主心肌里存活，并有效改善MI后左室功能，減小梗死面積。③同種異體MSCs移植