轉(zhuǎn)染HCN4基因的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同種異體移植對傳導(dǎo)阻滯心臟電生理變化的影響.pdf

1、背景與目的:
　　生物起搏(BiologicalPacemaker)是利用細(xì)胞技術(shù)和基因技術(shù),將目的基因(起搏基因或可促進(jìn)心臟自主節(jié)律的基因)直接導(dǎo)入心臟或者利用各種起搏/非起搏細(xì)胞將起搏電流傳遞至疾病的心臟,使其能在局部發(fā)揮其接近生理狀態(tài)的起搏或提高心率的作用。本研究擬通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)和細(xì)胞治療技術(shù),利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為傳遞起搏電流的細(xì)胞平臺,試圖在動物體內(nèi)“構(gòu)建”生物心臟起搏器,以探索治療緩慢型心律失常疾病的新

2、方法。本研究是在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合國內(nèi)外這一領(lǐng)域研究的最新成果,就小鼠HCN4基因(mHCN4)轉(zhuǎn)染犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(cMSCs)同種異體移植對完全性房室傳導(dǎo)阻滯(CAVB)心臟電生理改變的影響進(jìn)行探索。包括以下三方面內(nèi)容:(1)利用攜帶mHCN4基因的慢病毒載體(Lentiviral-mHCN4),將mHCN4基因轉(zhuǎn)染到cMSCs,體外構(gòu)建可表達(dá)功能性起搏通道的起搏樣干細(xì)胞(Lv-mHCN4-cMSCs);(2)將構(gòu)建好

3、的起搏樣干細(xì)胞(mHCN4-cMSCs),同種異體移植到已植入電子心臟起搏器的CAVB模型犬心室肌內(nèi),通過監(jiān)測全天心律、運(yùn)動變時性研究、神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)性研究、組織學(xué)和分子生物學(xué)等,評價細(xì)胞移植對傳導(dǎo)阻滯心臟心室自律性的影響;(3)將mHCN4-cMSCs同種異體移植到CAVB模型犬心室肌內(nèi),觀察其對傳導(dǎo)阻滯心臟的致心律失常相關(guān)電生理參數(shù)的改變有無影響,以探索和評價利用mHCN4-cMSCs心室移植增強(qiáng)傳導(dǎo)阻滯心臟生物起搏功能的安全性和臨床

4、應(yīng)用可行性。
　　方法:
　　1.利用構(gòu)建好的Lentiviral-EGFP-mHCN4慢病毒載體進(jìn)行293T細(xì)胞病毒包裝,將mHCN4基因轉(zhuǎn)染到第2-3代cMSCs,得到Lentiviral-EGFP-mHCN4-cMSCs(HCN4組細(xì)胞,以下簡稱mHCN4-cMSCs);對照組cMSCs只轉(zhuǎn)染Lentiviral-EGFP,得到EGFP-cMSCs。待熒光顯微鏡觀察到兩組cMSCs穩(wěn)定表達(dá)HCN4通道蛋白和綠色熒光蛋白

5、(GFP)后,利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對兩組轉(zhuǎn)染陽性的cMSCs進(jìn)行通道電生理學(xué)研究。
　　2.取成年犬射頻消融希氏束建立完全性房室傳導(dǎo)阻滯(CAVB)動物模型,并在頸部皮下植入電子起搏器。1周后對模型犬進(jìn)行開胸手術(shù),將mHCN4-cMSCs(HCN4組)或EGFP-cMSCs(對照組)懸液斜行注入左心室前壁(第一對角支和第二對角支之間區(qū)域)處心外膜下,并在該處心外膜進(jìn)行超速起搏,做好標(biāo)記。
　　3.術(shù)后對各組模型犬的心室自律性

6、和移植部位組織目的基因蛋白表達(dá)進(jìn)行綜合檢測和分析。主要采用體表心電圖QRS波形分析、24小時動態(tài)心電圖心律變化記錄、起搏器活動日志記錄分析、其對于神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和體能運(yùn)動的反應(yīng)能力評估心室自律性變化;用組織病理學(xué)HE染色、免疫組織熒光染色技術(shù)和WesternBlot分子生物學(xué)技術(shù)等多項(xiàng)技術(shù)方法對細(xì)胞移植后體內(nèi)存活和目的基因蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　4.另取健康成年犬開胸,于心外膜直視下用程序電刺激(PES)的方法測定其各局部(左室前壁

7、擬注射細(xì)胞部位、右室前壁、左室游離壁下部)心臟電生理基礎(chǔ)參數(shù),包括:舒張期起搏閾值(DPT)、心室有效不應(yīng)期(VERP)、心室有效不應(yīng)期差值(ΔVERP)、單項(xiàng)動作電位時程(MAPD)、單項(xiàng)動作電位時程差值(ΔMAPD)、室顫閾值(VFT)。測定之后做好注射部位標(biāo)記,在標(biāo)記處附近注射mHCN4-cMSCs(HCN4組)、EGFP-cMSCs(cMSCs對照組)和生理鹽水(鹽水組),然后關(guān)胸。
　　5.1周后對HCN4組和細(xì)胞對照組

8、犬制備CAVB模型,鹽水對照組不進(jìn)行CAVB制作,術(shù)后每96小時檢查24小時動態(tài)心電圖。4周后各組再次開胸行PES測定心臟電生理參數(shù),處死動物,取材利用組織病理學(xué)HE染色、免疫組織化學(xué)染色、westernblot技術(shù)檢測移植部位細(xì)胞存活和HCN4蛋白表達(dá)及移植部位邊緣心室肌縫隙連接蛋白43(CX43)表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.慢病毒載體Lentiviral-EGFP-mHCN4經(jīng)包裝后轉(zhuǎn)染第3-4代犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的

9、轉(zhuǎn)染陽性率約為65％,經(jīng)免疫熒光染色技術(shù)測定其膜表面可表達(dá)HCN4蛋白,經(jīng)多次傳代后細(xì)胞生長狀態(tài)依然良好,仍可表達(dá)HCN4蛋白。
　　2.利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞進(jìn)行電生理研究,能夠記錄到類似If特性的細(xì)胞膜通道離子電流。該電流具備超極化鉗制電壓激活和時間依賴的特點(diǎn),對細(xì)胞內(nèi)cAMP反應(yīng)良好,符合起搏電流If的典型特征。而EGFP對照組細(xì)胞(轉(zhuǎn)染lentiviral-EGFP)檢測不出類似特性的電流。
　　3.將

10、mHCN4-cMSCs(HCN4組)和EGFP-cMSCs(對照組)移植到已植入電子心臟起搏器的CAVB模型犬的左心室心外膜下。在移植后第2周內(nèi),24小時動態(tài)心電圖及每周體表心電圖檢查提示HCN4組8只犬中有6只出現(xiàn)起源于左室的自主心律,占總心搏數(shù)的比例高于60%;并且在第2周末時犬運(yùn)動時最大心率達(dá)到最高103±12bpm(對照組為50±3bpm),同時休息時的靜息心率和平均心率也隨著時間逐漸增加,到第4周時趨于穩(wěn)定(基礎(chǔ)心率55±6b

11、pm,平均心率59±5bpm)。且明顯高于對照組對應(yīng)心率指標(biāo)(基礎(chǔ)心率27±2bpm,平均心率38±2bpm)。HCN4組電子起搏率從第2周開始下降,到第4周時下降至6±2%,而對照組則為57±7%。通過神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)性測試證實(shí),這一異位起搏心律對阿托品無明顯反應(yīng),但對腎上腺素反應(yīng)良好,同時對生理性體能運(yùn)動也有良好的變時性。
　　4.用組織病理學(xué)、免疫熒光化學(xué)染色和分子生物學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞移植部位的心室肌標(biāo)本,證實(shí)移植的MSCs細(xì)胞能

12、夠在移植部位存活至少6周,局部未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡壞死和免疫排斥反應(yīng)。免疫熒光組織化學(xué)研究證實(shí)異體移植的MSCs細(xì)胞能夠在移植部位有效表達(dá)HCN4通道蛋白,且其表達(dá)量明顯超過注射未轉(zhuǎn)染基因的對照組。
　　5.心臟電生理參數(shù)測定結(jié)果顯示犬在模型制備前各組間參數(shù)無顯著差異;細(xì)胞移植+CAVB模型后4周細(xì)胞對照組QT、QTc、DPT、VERP、MAPD顯著高于鹽水對照組(P<0.01)和HCN4組(P<0.05),ΔVERP、ΔMAPD

13、顯著高于鹽水對照組(P<0.01),VFT低于鹽水對照組(P<0.01)和HCN4組(P<0.05);HCN4組ΔVERP、ΔMAPD顯著高于細(xì)胞對照組(P<0.01),VFT高于細(xì)胞對照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.利用慢病毒載體可在體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mHCN4基因至犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)HCN4通道蛋白。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞進(jìn)行膜通道電流檢測,證實(shí)其在體外培養(yǎng)環(huán)境下可表達(dá)對cAMP反

14、應(yīng)敏感的起搏樣電流IHCN4,因此我們把這種細(xì)胞稱為起搏樣干細(xì)胞mHCN4-cMSCs。
　　2.將mHCN4-cMSCs同種異體移植到完全性房室傳導(dǎo)阻滯犬心室肌后,能在機(jī)體內(nèi)存活達(dá)6周,且在體內(nèi)繼續(xù)表達(dá)HCN4蛋白,并可有效提高移植部位的室性自主節(jié)律,減少電子起搏器依賴,并且這種生物起搏心律具有良好的變時性和神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)性。
　　3.健康犬在心臟傳導(dǎo)阻滯后其心室電生理特性明顯改變,各致心律失常敏感性指標(biāo)均高于健康狀態(tài);在心