膜片鉗原位檢測HCN4基因修飾的MSCs移植至大鼠心臟后的細胞電生理變化.pdf

1、背景與目的：
　　電子心臟起搏器是目前臨床上有效治療緩慢性心律失常的常規(guī)方法,但存在費用昂貴、電池壽命有限、起搏器缺乏對神經(jīng)激素的自動反應(yīng)性等不足,且可能出現(xiàn)出血、感染等并發(fā)癥。近年來,隨著對起搏細胞離子通道基因的了解進一步深入,利用生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù),對受損的心臟起搏點進行修復(fù)或替代,重建心臟“生物起搏點”,使心臟的起搏和傳導(dǎo)功能得以恢復(fù),已成為當前心臟電生理學(xué)界研究的熱點。
　　起搏電流(currentfunny,If)

2、是竇房結(jié)細胞舒張期自動除極化的主要決定因素,并在心率控制及神經(jīng)遞質(zhì)對心率的調(diào)節(jié)中起重要作用;超極化激活的環(huán)化核苷酸門控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)通道基因家族編碼的HCN通道則是If形成的分子基礎(chǔ)。目前已有利用HCN基因修飾的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植進入房室傳導(dǎo)阻滯的動物模型中成功創(chuàng)建生物起搏點的報道,

3、結(jié)果令人鼓舞,但有一些關(guān)鍵的問題仍亟待解決。首先,在體研究發(fā)現(xiàn)生物起搏的頻率低下(約40~50bpm,也有低至30bpm的情況),顯著低于與體外心肌細胞共培養(yǎng)時的起搏頻率,是否起搏電流的特性發(fā)生了改變?具體原因尚不清楚;其次,MSCs具有多向分化的潛能,其移植到宿主心臟后,僅作為一個載體工具,還是分化為具備功能的心肌樣細胞發(fā)揮起搏作用?以上問題對于移植細胞能否在體內(nèi)穩(wěn)定、持久的發(fā)揮起搏功能至關(guān)重要。
　　然而,由于缺乏對移植細胞直

4、接進行原位功能檢測的手段,目前多數(shù)研究主要是通過免疫組織化學(xué)檢測移植細胞的表型變化,以及通過宏觀的心電圖、三維電解剖標測系統(tǒng)(CARTO)等無創(chuàng)檢查對移植細胞的起搏功能進行評估。但移植細胞表型的改變并不等同于具備了心肌細胞樣的功能;無創(chuàng)檢查的空間分辨力有限,不能對“體內(nèi)干細胞和心肌細胞如何交互作用影響心臟功能”進行精確描述。因此,目前的研究尚不能真正闡明移植細胞在宿主心臟中發(fā)揮起搏功能及起搏功能發(fā)生改變的機制。
　　眾所周知,起搏

5、電流(funnycurrent,If)是起搏細胞發(fā)揮功能的基礎(chǔ),而膜片鉗技術(shù)是檢測細胞膜離子通道電流的最根本、有效的方法。利用膜片鉗技術(shù)針對移植細胞進行原位的電生理學(xué)研究,將有助于闡明起搏細胞的電生理學(xué)特性及其與宿主心肌細胞交互作用的機制。對移植細胞進行原位膜片鉗檢測需要在組織切片上進行,但目前尚未發(fā)現(xiàn)利用成年動物心肌組織切片膜片鉗技術(shù)原位檢測移植干細胞電生理特性及其與宿主心肌細胞交互作用功能的報道。本實驗擬利用組織片膜片鉗技術(shù),對同種

6、異體移植到宿主心臟中的mHCN4基因修飾的大鼠MSCs(HCN4-MSCs)進行原位電生理學(xué)研究。
　　方法：
　　1.取健康SD大鼠骨髓,經(jīng)密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)獲得MSCs,在體外擴增、純化。
　　2.構(gòu)建mHCN4的表達載體pLenti6.3-mHCN4-IRES2-EGFP(LV-HCN4-EGFP)及空載體pLenti6.3-IRES2-EGFP(LV-EGFP),分別轉(zhuǎn)染第三代的MSCs,5~7天后利用免疫

7、組化方法及膜片鉗方法檢測起搏離子通道蛋白及電流的表達。
　　3.將MSCs同種移植到SD大鼠心臟中創(chuàng)建細胞移植模型,在此基礎(chǔ)上建立適合于膜片鉗檢測的心肌組織切片方法。
　　4.將SD大鼠分為兩組(每組各10只):1)實驗組移植轉(zhuǎn)染mHCN4的MSCs(HCN4-MSCs);2)體內(nèi)對照組移植僅轉(zhuǎn)染EGFP的MSCs。各組大鼠在細胞移植4周后處死,取心臟進行切片,對移植細胞進行原位的膜片鉗檢測。同時,另設(shè)兩個組作為體外對照:1

8、)HCN4-MSCs體外培養(yǎng)1周組,2)HCN4-MSCs體外培養(yǎng)4周組。在本研究中,上述4組分別被定義如下:實驗組,體內(nèi)對照組,體外對照組(1)及體外對照組(2)。利用膜片鉗技術(shù)對各組細胞的起搏電流(If)進行檢測,并對各組細胞記錄到的If電流特性進行比較和分析。并檢測實驗組及體內(nèi)對照組移植細胞的動作電位、鈉電流及鈣電流。
　　5.在全細胞膜片鉗封接的基礎(chǔ)上,結(jié)合熒光黃染料轉(zhuǎn)運的實驗方法,檢測移植細胞與宿主心肌細胞之間的縫隙連接

9、通訊功能。
　　6.膜片鉗檢測結(jié)束后,將心肌組織用4％多聚甲醛常規(guī)固定、石蠟包埋、切片,利用免疫熒光方法檢測移植細胞HCN4及EGFP蛋白的表達;利用免疫組化的方法檢測縫隙連接蛋白43(connexin43,CX43)的表達及分布,以及移植區(qū)域IgG的表達及CD3+T細胞的浸潤。
　　結(jié)果：
　　1.本實驗分離純化的MSCs高表達CD29和CD44抗原(高達99%以上),而CD34和CD45抗原表達與同型對照沒有顯著差

10、異;并且在特定的誘導(dǎo)條件下,MSCs可以分化為心肌樣細胞、成骨細胞及脂肪細胞,證實其多向分化潛能。以上特性符合目前公認的MSCs標準。
　　2.在MOI=10的條件下,慢病毒對MSCs的轉(zhuǎn)染效率可以達到67.0±6.6%(n=5),MSCs形態(tài)及活性未受明顯影響。轉(zhuǎn)染“pLenti6.3-mHCN4-IRES2-EGFP”的MSCs同時表達EGFP及mHCN4蛋白,并記錄到可被4mMCsCl可逆性阻斷的超極化激活的內(nèi)向電流,證實為

11、起搏電流If;而轉(zhuǎn)染“pLenti6.3-IRES2-EGFP”的MSCs僅表達EGFP,未記錄到起搏電流If。
　　3.通過改良的心肌組織切片方法,獲得了活性良好、背景熒光低的心肌組織切片。在切片中,心肌細胞結(jié)構(gòu)完整、橫紋清晰可見;移植的MSCs呈簇狀分布在心肌細胞的縫隙之間,細胞呈類圓形、短梭形,形態(tài)完整、表面光滑,與心肌細胞緊密連接。在熒光條件下,心肌組織自發(fā)熒光背景較低,可以觀察到EGFP標記的MSCs。通過全細胞膜片鉗方

12、式,分別記錄到了組織片中心肌細胞及移植的MSCs細胞的膜電流,證實細胞活性良好,完全能夠滿足針對移植MSCs進行原位膜片鉗檢測的需要。
　　4.實驗組移植的HCN4-MSCs在宿主心臟中能存活4周以上。實驗組與體外對照組(1)及體外對照組(2)的HCN4-MSCs表達超極化激活的起搏電流(If)。體內(nèi)對照組的MSCs不表達If。
　　(1)實驗組與體外對照組(1)及體外對照組(2)相比,三組間If電流幅值無顯著差異[分別為-

13、1007.4±132.3pA(n=14)、-1012.5±187.3pA(n=16)及-1025.5±200.9pA(n=15),P>0.05]。三組間細胞膜電容比較有顯著性差異(P值均<0.05),其中實驗組(6.8±1.2pF,n=14)<體外對照組(1)(25.0±5.6pF,n=16)<體外對照組(2)(32.4±4.8pF,n=15)。三組間電流密度分別為-151.7±26.1pA/pF(n=14),-41.6±7.7pA/p

14、F(n=16)及-31.7±4.0pA/pF(n=15),差異亦達顯著性(P值均<0.05)。
　　(2)實驗組If電流的激活閾電位為-46.7±5.9mV(n=20),明顯低于體外對照組(1)(-40.6±4.4mV,n=20)及體外對照組(2)(-41.3±5.2mV,n=22),P值均<0.05;而兩個體外對照組之間無顯著差異(P=0.181)。
　　(3)與體外對照組(1)及體外對照組(2)If電流的半激活電壓[分別

15、為-94.8±7.8mV,n=16;-96.4±6.6mV,n=15]相比,實驗組If電流的半激活電壓(-107.8±14.6mV,n=14)分別負移了大約13mV及11mV,差異達到顯著性(P值均<0.05)。而兩個體外對照組之間無顯著差異(P=0.553)。
　　(4)實驗組的If電流激活曲線的斜率為-13.7±1.7(n=14),與體外對照組(1)(-11.5±1.8,n=16)及體外對照組(2)(-11.2±2.2,n=1

16、5)相比,均達到顯著差異(P值均<0.05),而兩個體外對照組之間無顯著差異(P=0.717)。
　　(5)在指令電壓為-140mV時,實驗組If電流的激活時間常數(shù)為509.8±66.6ms(n=6),與體外對照組(1)(405.6±64.5ms,n=8)及體外對照組(2)(427.5±62.2ms,n=7)相比,有更緩慢激活的趨勢,但三組之間的差異未達顯著性(P=0.051)。
　　(6)三組If電流的翻轉(zhuǎn)電位分別為實驗組

17、-32.3±3.3(n=8),體外對照組(1)-29.5±3.9(n=11),體外對照組(2)-30.9±3.0(n=10),三者之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　(7)3μM異丙腎上腺素能夠使實驗組If電流激活曲線的半激活電壓正移約9.7mV(從-106.5±9.5mV到-96.8±8.7mV,n=4;P<0.05),但對激活曲線的斜率影響不明顯(從-12.8±2.1到-12.9±1.8,n=4;P>0.05)。
　

18、　5.在實驗組、體內(nèi)對照組及兩個體外對照組中,均未能在MSCs上記錄到去極化激活的內(nèi)向INa或ICa-L電流,亦未能記錄到動作電位。在膜片鉗全細胞記錄模式的基礎(chǔ)上進行的熒光染料轉(zhuǎn)運實驗中,未發(fā)現(xiàn)熒光素黃染料從被檢測的HCN4-MSCs(n=6)擴散到周圍的心肌細胞中。
　　6.免疫組化檢測結(jié)果顯示,只有極少數(shù)的移植HCN4-MSCs表達CX43,且CX43以點狀的模式隨意分布于細胞的接觸界面上,與心肌細胞的CX43分布(局限在閏盤

19、)顯著不同。移植區(qū)域未見IgG的表達及CD3+T細胞的浸潤。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗建立了一種能夠滿足膜片鉗檢測需要的心肌組織切片方法,并在此基礎(chǔ)上成功對移植到宿主心肌組織中的起搏細胞進行了原位的電生理學(xué)研究。
　　2.mHCN4基因修飾的大鼠MSCs(HCN4-MSCs)同種移植到宿主心臟中能存活4周以上,并持續(xù)表達超極化激活的起搏電流(If)。體內(nèi)對照組的MSCs(MSCs-EGFP)不表達If。
　　3

20、.移植的HCN4-MSCs表達的If電流幅值與體外對照組相似,但膜電容及電流密度與體外對照組細胞有顯著差異。與體外對照組的細胞相比,移植的HCN4-MSCs的If電流激活閾電位及半激活電壓顯著負移(差異達顯著性),激活曲線斜率增大(差異達顯著性),激活時間常數(shù)延長(但差異未達顯著性),翻轉(zhuǎn)電位無顯著差異。
　　4.移植后4周,HCN4-MSCs及MSCs-EGFP均不表達去極化激活的內(nèi)向鈉電流及鈣電流,未記錄到動作電位。MSCs與