NT-3基因修飾的MSCs移植促進大鼠脫髓鞘脊髓損傷修復(fù)的研究.pdf

1、本實驗旨在研究神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)移植入大鼠脫髓鞘脊髓損傷處，通過移植的MSCs自分泌外源性NT-3，誘導(dǎo)其向少突膠質(zhì)細胞分化，重建髓鞘結(jié)構(gòu)，修復(fù)脫髓鞘脊髓的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。這將豐富人們對基因修飾的MSCs移植治療脫髓鞘脊髓模型動物的實驗機制理解，為基因修飾的MSCs移植治療相關(guān)的脫髓鞘疾病提供實

2、驗依據(jù)。為驗證上述研究設(shè)想，現(xiàn)將實驗內(nèi)容分以下三部分：
　　 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)、檢測及NT-3基因重組腺病毒的轉(zhuǎn)染和鑒定
　　 目的：用重組腺病毒為載體，體外構(gòu)建NT-3基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)，為細胞移植提供穩(wěn)定的細胞來源。
　　 方法：從幼年雄性SD大鼠股骨中獲取全骨髓細胞，通過不斷傳代使MSCs純化。NT-3基因重組腺病毒(AdvNT-3)感染純化的MSCs細胞48h。X

3、-gal和NT-3免疫熒光染色檢測NT-3基因重組腺病毒的轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)果：選取經(jīng)過轉(zhuǎn)染攜帶有LacZ基因腺病毒的MSCs培養(yǎng)孔板，用X-gal組織化學(xué)染色顯示轉(zhuǎn)染率約為30～40％。這表明在NT-3基因重組腺病毒的感染MSCs的轉(zhuǎn)染率可能也有30～40％。免疫熒光組化染色結(jié)果顯示，在脊髓脫髓鞘區(qū)域內(nèi)移植的NT-3基因轉(zhuǎn)染MSC可持續(xù)表達NT-3至少3周。
　　 結(jié)論：在體外能夠獲得較穩(wěn)定表達NT-3基因轉(zhuǎn)染的MS

4、Cs，這為體內(nèi)細胞移植提供可靠的NT-3基因轉(zhuǎn)染的MSCs。
　　 第二部分EB誘導(dǎo)脊髓脫髓鞘大鼠模型的建立
　　 目的：探討溴化乙錠(ethidium bromide，EB)注射所致的脫髓鞘脊髓損傷大鼠模型的建立及鑒定。
　　 方法：將25只SD大鼠(雌性，體重：220g～280g)分為2組，其中A組皆行EB造模，B組注射PBS做為對照。2組大鼠經(jīng)麻醉后，在T9～10胸髓處局部垂直注射1μlEB(1mg/ml)

5、或1μlPBS。3周后進行HE、Luxol Fast Blue(LFB)、APC、GFAP免疫熒光組織化學(xué)染色和半薄切片觀察、透射電鏡觀察。
　　 結(jié)果：對兩組大鼠脊髓組織進行H染色、LFB組織化學(xué)染色、APC和GFAP免疫熒光組織化學(xué)染色，可見A組脊髓背角脫髓鞘區(qū)域的星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞大量丟失。光鏡半薄切片和電鏡超薄切片觀察，皆可見脊髓脫髓鞘區(qū)域有大量明顯潰變的髓鞘。
　　 結(jié)論：EB注射能夠成功制備大鼠脊髓局

6、部脫髓鞘模型。
　　 第三部分NT-3基因轉(zhuǎn)染的MSCs移植對大鼠脫髓鞘脊髓損傷修復(fù)的影響及其機制的探討
　　 目的：應(yīng)用NT-3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染的MSCs移植入EB模型大鼠脊髓內(nèi)，觀察這種細胞治療策略對脫髓鞘損傷后的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的影響，與此同時對其修復(fù)機制進行初步探討。
　　 方法：將上一章已造模大鼠分為：A.AdvNT-3-MSCs組。B.AdvLacZ-MSCs組C.MSCs組。D.EB組。E.PBS組

7、；其中：A、B、C、D組均來自上一章的A組(EB損傷組)；E組來自上一章的B組(PBS組)。5組大鼠皆于術(shù)后，每周施行兩次獨木橋功能評分。并在觀察3周(21天)后，行電生理檢測及NG2、APC等少突膠質(zhì)細胞標志物的免疫熒光染色，熒光顯微鏡下對AdvNT-3-MSCs組、MSC細胞移植組、AdvLacZ-MSCs組大鼠進行細胞計數(shù)統(tǒng)計比較陽性細胞數(shù)及計算其分化率。光鏡半薄切片定量檢測新生髓鞘、正常髓鞘及脫髓鞘形態(tài)數(shù)量及各組髓鞘存活率、電鏡

8、超薄切片觀察各組髓鞘形態(tài)。
　　 結(jié)果：獨木橋功能測試評分結(jié)果顯示，AdvNT-3-MSCs組大鼠后肢活動功能恢復(fù)成與PBS組一樣，沒有明顯差異；與其余組比較皆有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；電生理測試結(jié)果顯示，AdvNT-3-MSCs組大鼠脊髓誘發(fā)電位峰峰值與PBS組比較，沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異；與EB組以及其它細胞移植組比較，均有明顯差異(P＜0.05)。免疫熒光組織化學(xué)染色陽性細胞計數(shù)結(jié)果顯示，AdvNT-3-MSCs組的NG2