紅花黃素腹腔注射聯(lián)合MSCs移植對(duì)大鼠損傷脊髓修復(fù)作用研究.pdf

1、目的：脊髓損傷是一種常見病、多發(fā)病，可以造成損傷平面以下不可逆的感覺、運(yùn)動(dòng)及括約肌功能障礙，臨床治療效果不理想，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用對(duì)脊髓損傷具有保護(hù)作用的紅花黃素腹腔注射聯(lián)合MSCs移植治療大鼠脊髓損傷模型，探討紅花黃素腹腔注射和MSCs移植對(duì)損傷脊髓修復(fù)作用的機(jī)制，為提高脊髓損傷臨床治療效果尋找一條可行的途徑。
　　 方法：貼壁分離法分離純化大鼠MSCs，觀察原代及傳代MSCs的形態(tài)特點(diǎn)、生長(zhǎng)特性，探討其作

2、為種子細(xì)胞的可行性并用流式細(xì)胞分析技術(shù)鑒定MSCs表面蛋白表達(dá)。攜帶GFP基因的腺病毒感染MSCs，熒光顯微鏡觀察MSCs轉(zhuǎn)染情況并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，觀察GFP-MSCs形態(tài)特點(diǎn)、生長(zhǎng)特性，研究GFP標(biāo)記對(duì)MSCs生物學(xué)性狀的影響。55只成年S-D大鼠，雌雄各半，根據(jù)處理方法的不同，隨機(jī)分為5組：A組(紅花黃素腹腔注射+MSCs移植組)、B組(生理鹽水腹腔注射+MSCs移植組)、C組(紅花黃素腹腔注射+PBS組)和D組(生理鹽水腹腔注射+P

3、BS組)，以上每組各10只；E組為補(bǔ)充組，15只。改良Al1en法T7平面制作脊髓損傷模型。造模成功后，A組和B組損傷局部即時(shí)直接移植標(biāo)記后的MSCs(GFP-MSCs)6×106/60μl，C組和D組注射同等體積PBS。A組和C組術(shù)后按40mg/kg的劑量腹腔注射紅花黃素，B組和D組注射同等劑量的生理鹽水，每日1次，共用2w。實(shí)驗(yàn)過程中，各組的死亡動(dòng)物后從E組中隨機(jī)選取補(bǔ)充，重新開始計(jì)算模型動(dòng)物的喂養(yǎng)處理時(shí)間，以保證各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)目的

4、相同。術(shù)后1w、2w、3w和4w時(shí)采用BBB評(píng)分法進(jìn)行后肢功能評(píng)分后心臟灌注取材，制作冰凍切片，熒光顯微鏡觀察移植的MSCs；HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化；免疫組化檢測(cè)GFAP、NeuN和NGF的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.貼壁分離法分離純化的貼壁細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性與MSCs一致，流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)：CD45陽性率14.47％，CD44陽性率89.26％，CD29陽性率93.27％提示獲得的細(xì)胞是M

5、SCs；
　　 2.攜帶GFP基因的腺病毒感染MSCs后，熒光顯微鏡觀察證實(shí)MSCs的GFP標(biāo)記成功，腺病毒的轉(zhuǎn)染效率為(93％±2％)，轉(zhuǎn)染后MSCs的形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特性無明顯變化；
　　 3.熒光顯微鏡下，GFP-MSCs移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)1w、2w、3w和4w時(shí)的冰凍組織切片均可觀察到GFP-MSCs發(fā)出的明亮的綠色熒光，證明移植的MSCs可以在大鼠損傷的脊髓中存活；
　　 4.術(shù)后2w-4W，紅花黃素腹腔注射

6、或MSCs移植的單獨(dú)應(yīng)用均可提高大鼠BBB評(píng)分的得分，二者聯(lián)用作用更加明顯，差異有顯著性(P＜0.05)，術(shù)后1w時(shí)，各組間評(píng)分的差異性不顯著(P＞0.05)；
　　 5.術(shù)后1w、2w、3w和4w各個(gè)時(shí)間點(diǎn)冰凍組織切片HE染色顯示紅花黃素腹腔注射或MSCs移植的單獨(dú)應(yīng)用均可改善神經(jīng)組織病變情況，減少空腔的形成，其改善程度和BBB評(píng)分得分情況一致，二者聯(lián)用病變作用更加明顯；
　　 6.免疫組化檢測(cè)顯示各組GFAP、Neu

7、N和NGF表達(dá)均隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，相同時(shí)間點(diǎn)同一指標(biāo)A組、B組和C組的表達(dá)水平明顯高于D組，差異有顯著性(P＜0.05)，其中A組的表達(dá)水平又高于B組和C組，差異有顯著性(P＜0.05)，B組的表達(dá)水平高于C組，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.貼壁分離法是一種較好的MSCs分離方法，所獲貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，活力良好，流式細(xì)胞分析技術(shù)證實(shí)為MSCs，可用作組織工程的種子細(xì)胞；
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