紅花黃素腹腔注射聯(lián)合MSCs移植對脊髓損傷大鼠運(yùn)動功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)的治療仍然是一個世界性的難題。本實驗中應(yīng)用紅花黃素腹腔注射聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療大鼠模型SCI，探討紅花黃素腹腔注射和MSCs移植對脊髓損傷大鼠運(yùn)動功能的影響及作用機(jī)制，為提高SCI臨床治療效果尋找新的治療措施。
　　 方法：貼壁培養(yǎng)分離法分離、純化大鼠MSCs；75只S-D大鼠隨機(jī)

2、分為5組，每組15只：A組(紅花黃素+MSCs組)，B組(生理鹽水+MSCs組)，C組(紅花黃素+PBS組)，D組(生理鹽水+PBS組)為對照組；E組(補(bǔ)充組)。改良Allen法制作脊髓損傷模型。造模成功后，A組和B組立即在損傷局部注射器注入60μl的濃度為1×105/μl的MSCs，C組和D組注入等體積的無菌PBS液；造模術(shù)后第1d起，A組和C組的動物給予腹腔注射紅花黃素治療(40mg/kg，1次/日)，直至動物被處死取材或治療達(dá)14

3、d；B組和D組中動物同法注射等體積的生理鹽水。實驗過程中，A、B、C、D組中若有動物死亡則從E組中隨機(jī)選取補(bǔ)充，以保證A、B、C、D組中實驗動物數(shù)目相同。于造模術(shù)后1d、2d、3d、4d、7d取各組損傷處脊髓檢測SOD、MDA和細(xì)胞凋亡，術(shù)后1d和7d、14d、21d，28d采用改良BBB評分法對各組動物進(jìn)行行為學(xué)檢查評分，同時取損傷處脊髓冰凍切片，HE染色顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用改良的A

4、llen法制作SCI模型：打擊時應(yīng)用導(dǎo)引筒導(dǎo)引重錘，使打擊更精準(zhǔn)；通過控制重錘的質(zhì)量和自由下落的高度能精確控制打擊量；在打擊部位加墊片，使打擊部位受力更均勻；打擊后立即移開重錘，防止了持續(xù)壓迫性損傷；通過操作技術(shù)培訓(xùn)和預(yù)實驗，保證了操作的熟練程度，最終使得每只大鼠脊髓損傷部位和損傷程度基本一致，具有可比性。造模后硬脊膜保持完整，但損傷脊髓組織在損傷后立即出現(xiàn)出血、水腫，漸出現(xiàn)組織壞死，隨后部分修復(fù)，最后見特征性的空腔形成、實質(zhì)細(xì)胞萎縮、

5、膠質(zhì)瘢痕形成，病理學(xué)表現(xiàn)與人類脊髓損傷有較好的一致性。
　　 2.造模前所有S-D大鼠BBB評分均為21分。造模后所有大鼠雙后肢、尾部遲緩性癱瘓，大小便失禁，尿潴留，只能以前肢拖著后半軀體匍匐前行。造模成功后24h時所有大鼠BBB評分均為0分。造模后7d內(nèi)所有大鼠后肢運(yùn)動功能均無明顯恢復(fù)，各組間差異性無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。7d后各組大鼠的后肢運(yùn)動功能逐漸出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，以A組的恢復(fù)速度最快，D組最差。造模后第14d、

6、21d、28d時BBB評分，A組、B組和C組明顯高于D組，且有A組高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B組和C組間差異不大。
　　 3.損傷脊髓組織切片HE染色顯示：(1)造模成功后1d時，損傷區(qū)域灰質(zhì)和白質(zhì)界限不清，中心區(qū)域的細(xì)胞結(jié)構(gòu)喪失，細(xì)胞形態(tài)無法辨認(rèn)，周圍區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞明顯腫脹、變性，大量的炎性細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞彌散，部分融合成片狀，有的區(qū)域形成空腔；各組之間差異不大；(2)7d后損傷修復(fù)情況好與壞與BBB評

7、分得分的高與低相一致，而且在A組和B組中可以見到細(xì)胞形態(tài)不同于神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的大體積細(xì)胞(考慮為移植的MSCs)，其數(shù)量與BBB評分得分高低呈同向變化，A組中大體積細(xì)胞數(shù)目多于B組，C組和D組未見類似細(xì)胞；各組空腔的數(shù)目和面積大小與BBB評分得分高低呈反向變化，A組在相同時間點(diǎn)空腔最少，D組最多，B組和C組的情況居中。
　　 4.脊髓損傷后，損傷脊髓組織內(nèi)SOD活性顯著降低，MDA明顯升高，在各時間點(diǎn)A組、B組和C組SOD活

8、性均高于D組(對照組)((P<0.05)，且A組明顯高于B組和C組(P<0.05)；在造模成功后3d、4d和7d時，A組、B組和C組MDA含量均低于D組(P<0.05)，且A組MDA含量在造模成功后2d、3d和4d時低于B組和C組(p<0.05)；在各相同時間點(diǎn)，A組、B組和C組的細(xì)胞凋亡數(shù)均少于D組(對照組)(p<0.05)，A組凋亡的細(xì)胞數(shù)還顯著少于B組和C組(p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.改良Allen

9、法制作大鼠SCI模型，操作簡單，重復(fù)性好，損傷脊髓的病理變化與人類SCI相似，滿足實驗研究的要求；
　　 2.紅花黃素腹腔注射能夠減少脊髓損傷局部自由基生成和減輕脂質(zhì)過氧化，抑制損傷脊髓組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而減輕繼發(fā)性損傷，促進(jìn)SCI后運(yùn)動功能的恢復(fù)；
　　 3.MSCs移植能夠減少脊髓損傷局部自由基生成和減輕脂質(zhì)過氧化，抑制損傷脊髓組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而減輕繼發(fā)性損傷，促進(jìn)SCI后運(yùn)動功能的恢復(fù)；