eNOS基因修飾EPCs移植與損傷內(nèi)膜修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 冠心病是嚴(yán)重威脅人類健康的一大類疾病，內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋在血管內(nèi)膜上的單層細(xì)胞，是循環(huán)血液與血管平滑肌間的機(jī)械屏障。內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種血管活性物質(zhì)，在維持血管舒縮功能、防止血小板黏附和血栓形成以及調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的生長和增殖等方面發(fā)揮重要作用。冠心病相關(guān)危險(xiǎn)因素可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡，破壞血管內(nèi)皮的完整性，繼而引起內(nèi)膜通透性增加、炎癥細(xì)胞浸潤、平滑肌細(xì)胞增生，促進(jìn)冠心病的發(fā)生、發(fā)展，

2、因此修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮對(duì)防治冠心病具有重要意義。 內(nèi)皮修復(fù)常需要損傷周邊成熟內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，然而成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力低，修復(fù)受損內(nèi)皮能力有限。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，表達(dá)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志，具有高增殖潛能及內(nèi)皮特性。在生理或病理?xiàng)l件下，EPCs可從骨髓動(dòng)員至外周血，歸巢到血管損傷部位，增殖分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)損傷內(nèi)皮的修復(fù)，同時(shí)通過旁分泌作

3、用調(diào)節(jié)血管舒縮功能。 方法： 1.pMSCV-eNOS的鑒定與擴(kuò)增通過RT-PCR及測序進(jìn)行鑒定；通過反復(fù)感染293細(xì)胞，擴(kuò)增攜帶人eNOS基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-eNOS)。 2.EPCs分離、培養(yǎng)及鑒定Ficoll密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，接種于包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，在添加了20％胎牛血清，50ng/mLVEGF，5ng/mLb-FGF，10ng/mLEGF的M199培養(yǎng)液中常

4、規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長特性及形態(tài)學(xué)變化，繪制EPCs生長曲線；通過免疫組化染色鑒定EPCs表面標(biāo)志eNOS、vWF表達(dá)，細(xì)胞熒光染色檢測EPCs與UEA-Ⅰ結(jié)合及對(duì)乙?；兔芏戎鞍?acLDL)攝取特性，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量，檢測EPCs分泌NO能力。 3.pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染對(duì)EPCs增殖、黏附、遷移的影響及NO及VEGF的分泌通過病毒感染構(gòu)建eNOS過表達(dá)的EPCs細(xì)胞模型，通過綠色熒光蛋自(GFP)

5、的表達(dá)，檢測感染效率。用RT-PCR、Western-blot檢測受感染EPCs內(nèi)eNOS的mRNA和蛋白表達(dá)，檢測通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染能否有效引起EPCs內(nèi)eNOS的過表達(dá)。 采用四氮唑溴鹽比色(MTT)法、改良的Boyden小室和黏附能力測定來觀察pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染對(duì)EPCs增殖、遷移和黏附能力的影響。通過硝酸還原酶法及ELISA法測定EPCs培養(yǎng)液中NO及VEGF含量。 4.pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染EPCs對(duì)內(nèi)

6、皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的作用培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，將eNOS基因修飾EPCs接種于下室，分別將平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞接種于上室，建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過MTT法及細(xì)胞周期測定分析eNOS基因修飾EPCs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖作用，用遷移計(jì)數(shù)方法觀察eNOS基因修飾EPCs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞遷移的影響。 5.轉(zhuǎn)染eNOS基因的EPCs移植在血管內(nèi)膜修復(fù)中的作用建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，將轉(zhuǎn)染eNOS基因

7、的EPCs通過尾靜脈移植至大鼠體內(nèi)。損傷后14d取目標(biāo)血管，通過RT-PCR、WesternBlot方法進(jìn)行檢測損傷血管局部eNOS的表達(dá)情況；行HE染色、伊文氏藍(lán)染色計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比及損傷血管再內(nèi)皮化比例，觀察eNOS基因修飾EPCs移植對(duì)損傷血管新生內(nèi)膜的影響。 結(jié)果： 1.鑒定已構(gòu)建好的pMSCV-eNOS，通過感染293細(xì)胞，攜帶人eNOS基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-eNOS)得到擴(kuò)增，獲得較高滴度

8、的病毒液。 2.EPCs培養(yǎng)鑒定細(xì)胞培養(yǎng)3-5d可以觀察到細(xì)胞增多增大并伸展呈紡錘形或短梭形細(xì)胞，有少量細(xì)胞突起。培養(yǎng)7-10d，梭形細(xì)胞較前明顯增多。 3.pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染對(duì)EPCs部分生物學(xué)功能的影響 (1)EPCs轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后eNOSmRNA和蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)EPCs轉(zhuǎn)染率達(dá)92％。pMSC-eNOS轉(zhuǎn)染EPCs后72h，RT-PCR和Westernblot檢測顯示細(xì)胞內(nèi)有eNOS的mRNA

9、和蛋白表達(dá)，NOS抑制劑L-NAME可抑制eNOS表達(dá)。 (2)pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染對(duì)EPCs增殖能力的影響MTT分析提示pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染EPCs可增加EPCs的增殖能力(pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組vs未轉(zhuǎn)染組，0.582±0.014vs0.357±0.009，P＜0.01)， (3)pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染對(duì)EPCs遷移功能的影響pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組可增加EPCs的遷移能力(pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組

10、vs未轉(zhuǎn)染組，20.50±1.87vs12.17±0.75，P＜0.01)，pMSCV-GFP轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組之間EPCs的增殖能力無顯著性差異(pMSCV-GFP轉(zhuǎn)染組vs未轉(zhuǎn)染組，12.33±1.03vs12.17±0.75，P＞0.05)，而L-NAME可顯著降低轉(zhuǎn)染后EPCs的遷移能力(pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組vsL-NAME干預(yù)組，20.50±1.87vs15.50±1.05，P＜0.01)。 (4)pMSCV-eN

11、OS轉(zhuǎn)染對(duì)EPCs黏附功能的影響pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染后EPCs黏附能力增強(qiáng)(pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組vs未轉(zhuǎn)染組，42.00±1.41vs30.67±0.82，P＜0.01)；pMSCV-GFP轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組間無顯著性差異(30.67±0.82vs30.00±1.41，P＞0.05)，L-NAME可降低轉(zhuǎn)染后EPCs的黏附能力(pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組vsL-NAME轉(zhuǎn)染組，42.00±1.41vs34.83±1.17，P＜0

12、.01)。 (5)pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染對(duì)EPCs分泌NO的影響eNOS基因轉(zhuǎn)染可顯著促進(jìn)EPCsNO的分泌(pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組vs未轉(zhuǎn)染組，68.32±1.46vs35.13±1.28，P＜0.01)，而抑制劑L-NAME可降低轉(zhuǎn)染后EPCsNO的分泌(pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組vsL-NAME干預(yù)組，68.32±1.46vs46.06±2.37，P＜0.01)。 (6)轉(zhuǎn)染pMSCV-eNOS對(duì)EPCs分泌

13、,VEGF的影響pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染EPCs可明顯促進(jìn)EPCs分泌VEGF(pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染組vs未轉(zhuǎn)染組，203.47±16.26vs153.71±14.17，P＜0.01)，pMSCV-GFP轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組之間無顯著性差異(156.32±1070vs153.71±14.17，P＞0.05)，L-NAME則抑制了轉(zhuǎn)染EPCs分泌VEGF的作用(203.47±16.26vs174.96±14.50，P＜0.01)。

14、 4.pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染EPCs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的作用pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染EPCs可促進(jìn)ECs的增殖(eNOS轉(zhuǎn)染組vs對(duì)照組，0.482±0.009vs0.361±0.009，P＜0.01)、遷移(eNOS轉(zhuǎn)染組vs對(duì)照組，17±1vs11±1，P＜0.01)，促進(jìn)ECs進(jìn)入S期(eNOS轉(zhuǎn)染組vs對(duì)照組，62.3±2.32vs43.9±1.21，P＜0.01)；pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染EPCs可抑制SMCs

15、的增殖(eNOS轉(zhuǎn)染組vs對(duì)照組，0.247±0.006vs0.350±0.004，P＜0.01)、遷移(eNOS轉(zhuǎn)染組vs對(duì)照組，11±1vs26±1，P＜0.01)，增加SMC停留在G1期的比例，抑制SMCs進(jìn)入S期(eNOS轉(zhuǎn)染組vs對(duì)照組，8.61±0.74vs15.08±1.96，P＜0.01)。 5.轉(zhuǎn)染eNOS基因的EPCs移植在血管內(nèi)膜修復(fù)中的作用成功建立了大鼠頸動(dòng)脈損傷模型，損傷后經(jīng)尾靜脈將轉(zhuǎn)染eNOS基因的E

16、PCs通移植至大鼠體內(nèi)。損傷后14d取目標(biāo)血管，RT-PCR、WesternBlot方法檢測損傷血管局部eNOS的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加，免疫組化表明eNOS-EPCs移植組損傷血管段eNOS表達(dá)明顯增強(qiáng)。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在血管損傷局部存在GFP示蹤的EPCs。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)EPCs移植可明顯抑制新生內(nèi)膜的過度增殖，而eNOS過表達(dá)可進(jìn)一步加強(qiáng)這種抗增殖效應(yīng)。Even’sblue染色提示EPCs移植可加速損傷血管處再內(nèi)皮化過程，

17、eNOS基因修飾的再內(nèi)皮化作用則更加明顯，再內(nèi)皮化面積＞50％。對(duì)Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能測定后發(fā)現(xiàn)，EPCs移植可改善內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)。eNOS基因修飾的EPCs可進(jìn)一步加強(qiáng)這種效應(yīng)。 結(jié)論： 1.逆轉(zhuǎn)錄病毒可以安全、有效的轉(zhuǎn)染EPCs，轉(zhuǎn)染率達(dá)90％以上。pMSCV-eNOS轉(zhuǎn)染EPCs后72h，RT-PCR和Westernblot檢測顯示細(xì)胞內(nèi)有eNOS的mRNA和蛋白表達(dá)，NOS抑制劑L-NAME