VEGF基因修飾MSC移植促進放射性腦損傷后腦微血管新生的實驗研究.pdf

1、放射性腦損傷(radiation injuries，brain；RIB)是頭頸部惡性腫瘤放射治療后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，原發(fā)腫瘤在得到放射治療的同時，RIB的出現(xiàn)成為限制腦部放射劑量、影響療效和降低病人生存質(zhì)量的重要因素。目前臨床對RIB治療以抗氧化、脫水劑、激素及對癥支持治療為主，無法從根本上逆轉(zhuǎn)其病情變化，所以尋找有效的治療方法十分必要。本課題組前期實驗曾嘗試堿性成纖維生長因子(bFGF)轉(zhuǎn)染C17.2神經(jīng)干細胞移植治療，發(fā)現(xiàn)對

2、RIB有一定的治療作用。引起RIB特別是晚期RIB的病理機制尚未完全闡明，近年來對放射性腦病發(fā)生機制的研究主要集中在血管內(nèi)皮細胞損傷和血腦屏障破壞方面。血管壁各成分中以內(nèi)皮細胞對放射線最敏感。有研究顯示，單次大劑量照射后24小時就可見內(nèi)皮細胞凋亡損失，這種損失可以持續(xù)52周，最后導(dǎo)致40％～65％的血管內(nèi)皮損失。大量的內(nèi)皮細胞損失導(dǎo)致微血管床破壞，伴隨微血管床破壞是微循環(huán)的明顯障礙，并導(dǎo)致腦的供血供氧減少，最終出現(xiàn)腦細胞壞死、脫髓鞘等病

3、理改變。特別是側(cè)支循環(huán)不發(fā)達的白質(zhì)，可出現(xiàn)片狀白質(zhì)壞死。所以微血管內(nèi)皮細胞可能是RIB的最主要效應(yīng)細胞。由此可見，尋找以腦微血管內(nèi)皮細胞再生為治療靶點的方法可能是治療RIB的最有效手段。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種最為有效的促血管生成因子，已有很多研究證實往缺血部位導(dǎo)入VEGF可以顯著誘導(dǎo)血管新生。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，

4、MSC)是有多項分化潛能的成體干細胞，來源廣泛，易于分離和培養(yǎng)，也是基因治療的一種合適的工具細胞。基因聯(lián)合細胞移植治療已經(jīng)在血管再生工程學(xué)上得到廣泛應(yīng)用。本研究的目的：構(gòu)建VEGF基因重組腺病毒(為便于在后續(xù)實驗中區(qū)別轉(zhuǎn)基因VEGF和宿主內(nèi)源性的VEGF，我們在VEGF目的片斷上添加一個HA標(biāo)簽)，轉(zhuǎn)染MSC，植入放射后大鼠腦微血管損傷區(qū)，觀察其分泌VEGF，是否可以促進該部位血管新生，改善腦功能。本實驗內(nèi)容分為三部分： 1、A

5、d—VEGF—HA重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定； 2、Ad—VEGF—HA重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSC和VEGF的表達及其分泌； 3、VEGF聯(lián)合MSC移植治療促進放射性腦微血管內(nèi)皮的新生。 第1章 Ad—VEGF—HA重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定 研究目的： 構(gòu)建Ad—VEGF—HA重組腺病毒并進行鑒定。 研究方法： pcDNA3.0-VEGF—HA(質(zhì)粒為山東大學(xué)張剛博士饋贈)測序后行EcorⅠ

6、和KpnⅠ雙酶切回收，與用同樣酶切回收的pAdtrack—CMV質(zhì)粒連接為pAdtrack—CMV—VEGF—HA，連接質(zhì)粒用Pme1酶切，回收目的片斷后與pAdeasy共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183、DH5a，鑒定后用Pac1酶切回收轉(zhuǎn)染HEK293A細胞進行包裝。約10天后細胞病變比較完全和細胞內(nèi)綠色熒光變?nèi)鯐r，回收、反復(fù)凍融HEK293A細胞，離心回收上清行酶切、電泳鑒定和病毒滴度測定。 結(jié)果： 1.鑒定pAdtrac

7、k—CMV—VEGF—HA穿梭質(zhì)粒、pAdeasy—CMV—VEGF—HA整合質(zhì)粒和重組腺病毒基因組內(nèi)含VEGF—HA基因。 2.HEK293A細胞內(nèi)熒光顯示病毒包裝成功。病毒滴度約為T≈1×1011GTU/mL。 結(jié)論： 成功構(gòu)建Ad—VEGF—HA重組腺病毒，為下一步轉(zhuǎn)染MSC做好準(zhǔn)備。 第2章 Ad—VEGF—HA重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSC和VEGF的表達及其分泌 研究目的： 將Ad—VE

8、GF—HA重組腺病毒轉(zhuǎn)染入MSC內(nèi)，使MSC穩(wěn)定表達并分泌VEGF。 研究方法： 全骨髓法(直接培養(yǎng)法)獲取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。MSC傳兩代后將細胞接種于25c㎡培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至90％融合時進行轉(zhuǎn)染。添加Ad—VEGF—HA重組腺病毒0.5ml(MOI=50)，轉(zhuǎn)染3小時后更換培養(yǎng)液，48小時后觀察轉(zhuǎn)化效率。免疫組化和方法測定VEGF表達。ELISA法檢測重組MSC細胞分泌的VEGF。 結(jié)果： 1.

9、Ad—VEGF—HA重組腺病毒感染MSC后6h(MOI=50)，部分細胞已經(jīng)有熒光顯示，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，熒光越來越強。轉(zhuǎn)化率可達80％。 2.抗HA免疫組化染色示重組MSC細胞胞漿中有褐色顆粒，表明其有VEGF—HA表達。 3.隨著重組MSC細胞的克隆性增殖，其分泌的VEGF也逐漸增多。經(jīng)ELISA法測定，一周后培養(yǎng)上清中的VEGF分泌量達平臺期，第8天時達2471ng/mL。據(jù)此，我們選擇培養(yǎng)一周的重組MSC細胞進

10、行移植。 結(jié)論： 成功將Ad—VEGF—HA重組腺病毒轉(zhuǎn)染入MSC內(nèi)，使MSC穩(wěn)定表達并分泌VEGF。為以后的移植治療做準(zhǔn)備。 第3章 VEGF修飾MSC移植治療促進放射性腦微血管內(nèi)皮的新生 研究目的： 建立大鼠RIB模型，將VEGF轉(zhuǎn)基因MSC移植入大鼠腦微血管損傷區(qū)，觀察移植區(qū)內(nèi)皮細胞密度變化，外源性VEGF分泌以及模型大鼠的行為學(xué)改變。 研究方法： SD大鼠全腦分割照射45

11、Gy，每次5Gy，共9次，3周內(nèi)完成制造RIB模型。A組為單純照射組，B組為轉(zhuǎn)基因干細胞移植組，C組為注射單純MSC移植組，D組注射同體積生理鹽水組，E組為未照射組。B組動物在最后一次照射完成后第7天，在立體定位儀下，微量注射器向右側(cè)內(nèi)囊區(qū)域注入5μL(1×105個)轉(zhuǎn)染VEGF的MSC細胞懸液。C組只注射5μL(1×105個)MSC細胞。治療后各時間點行冰凍切片觀察治療區(qū)域血管內(nèi)皮細胞標(biāo)記物Ⅷ因子免疫組化熒光標(biāo)記和GFP示蹤蛋白。5個

12、隨機高倍視野下Ⅷ因子陽性細胞數(shù)代表微血管密度(40×，0.13mm2)。Western blotting方法檢測治療部位VEGF—HA融合蛋白的表達情況。照射后各時間點觀察病理切片，EB法測血腦屏障改變，Morris水迷宮法檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。 結(jié)果： 1.移植后2周，B組治療部位組織病理切片在熒光顯微鏡下可見大量GFP顯示，3周后明顯減少。 2.移植后2周的，B組注射部位區(qū)組織Western blotting

13、檢測VEGF—HA融合蛋白的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射部位有較多VEGF—HA表達。 3.血管內(nèi)皮細胞標(biāo)記物Ⅷ因子免疫組化顯示，照射后1個月，與未照射組相比，內(nèi)囊區(qū)內(nèi)皮細胞密度已經(jīng)出現(xiàn)下降(P<0.01)，照射后3個月細胞密度進一步下降。照射后1個月和3個月B組較A組內(nèi)皮細胞密度增加(P<0.01)，C組內(nèi)皮細胞密度較A組有增加(P<0.05)，但少于B組(P<0.05)。 4.組織病理學(xué)顯示各組大鼠治療部位并未出現(xiàn)出血和白

14、質(zhì)壞死等改變。 5.受照后各組EB含量在照射后2周未見升高，照射后1個月開始，EB含量開始增加(P<0.05)；3個月較1個月時顯著增加。B組治療組的EB含量較A組單純照射組明顯減少(P<0.01)。 6.學(xué)習(xí)記憶能力檢測：照射后3個月和4個月，照射組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)進行性下降，B組學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善(P<0.01)。C組較A組學(xué)習(xí)記憶能力亦有改善，但改善幅度小于B組(P<0.01)。 結(jié)論： V