VEGF-C基因修飾的淋巴結(jié)移植促進(jìn)淋巴管再生的初步研究.pdf

1、背景：
　　 肢體淋巴水腫是醫(yī)學(xué)界尚未攻克的難題之一，其療效不佳、容易反復(fù)發(fā)作，仍缺乏有效的治療方法。淋巴結(jié)移植通過移植自體淋巴結(jié)，試圖恢復(fù)局部淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)與功能，以達(dá)到改善患肢淋巴回流、治療肢體淋巴水腫的目的。該方法為肢體淋巴水腫的治療提供了新的思路，被認(rèn)為是治療肢體淋巴水腫較有希望的手術(shù)方法之一。血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)具有促進(jìn)胚胎淋巴系統(tǒng)發(fā)育、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增生、淋巴管再生等作用，是目前淋巴系統(tǒng)再生方面研究的熱點(diǎn)。本

2、實(shí)驗(yàn)以腺病毒為載體，將VEGF-C基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到大鼠腋窩淋巴結(jié)移植模型的淋巴結(jié)中，觀察其在淋巴管再生中的初步作用，探討提高淋巴結(jié)移植療效的可行性方法。
　　 第一部分大鼠腋窩淋巴結(jié)移植模型的建立
　　 目的：
　　 建立大鼠腋窩淋巴結(jié)移植模型，并驗(yàn)證該模型進(jìn)行腋窩淋巴清掃的有效性。
　　 方法：
　　 以偶氮藍(lán)溶液皮下注射的方法使大鼠腋窩淋巴結(jié)顯色，觀察其周圍解剖結(jié)構(gòu)。在保留腋窩淋巴結(jié)血管蒂的基礎(chǔ)上徹

3、底清掃淋巴結(jié)周圍的淋巴管，將帶血管蒂的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、固定到新的部位，模擬淋巴結(jié)移植過程，建立大鼠腋窩淋巴結(jié)移植模型。通過于患肢前掌皮下注射0.2ml3％偶氮藍(lán)溶液，比較模型組、腋窩淋巴結(jié)清掃組、空白對照組大鼠腋窩結(jié)構(gòu)顯色情況以及經(jīng)處理的大鼠血液樣本在620nm下的吸光度，分析該模型對于腋窩淋巴結(jié)周圍淋巴管清掃的徹底程度，從而驗(yàn)證模型的有效性。
　　 結(jié)果：
　　 皮下注射偶氮藍(lán)后腋窩淋巴結(jié)移植組大鼠腋窩結(jié)構(gòu)顯色情況及其經(jīng)處

4、理的血液樣本在620nm下的吸光度均與腋窩淋巴結(jié)清掃組相似，與空白對照組有顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠腋窩淋巴結(jié)移植模型，該模型能有效地?fù)p傷腋窩淋巴結(jié)周圍的淋巴管，模擬淋巴結(jié)移植的過程。
　　 第二部分VEGF-C基因過表達(dá)的腺病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　 目的：
　　 構(gòu)建VEGF-C基因過表達(dá)的腺病毒載體，并使其轉(zhuǎn)染大鼠腋窩淋巴結(jié)移植模型的移植淋巴結(jié)。
　　 方法：

5、
　　 以AdMax系統(tǒng)構(gòu)建融合Flag標(biāo)簽的VEGF-C基因過表達(dá)腺病毒載體，對照組為過表達(dá)Flag標(biāo)簽的腺病毒載體。向大鼠腋窩淋巴結(jié)移植模型的淋巴結(jié)內(nèi)注射1.5×108pfu腺病毒，術(shù)后3天，摘取淋巴結(jié)制成冰凍切片，通過免疫熒光法檢測Flag標(biāo)簽的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建了融合Flag標(biāo)簽的VEGF-C基因過表達(dá)腺病毒載體，病毒滴度可達(dá)1.5×1011pfu/ml。免疫熒光顯示Flag標(biāo)簽在淋巴結(jié)

6、中有較強(qiáng)的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了VEGF-C基因過表達(dá)腺病毒載體，并成功將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至大鼠腋窩淋巴結(jié)移植模型的移植淋巴結(jié)中。
　　 第三部分VEGF-C基因修飾的淋巴結(jié)促進(jìn)淋巴管再生的初步研究
　　 目的：
　　 觀察短期內(nèi)VEGF-C基因修飾的淋巴結(jié)在促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增生、集合淋巴管再生，改善患肢淋巴回流中的作用。
　　 方法：
　　 以免疫熒光法檢測基因修飾

7、后1周、2周、4周淋巴結(jié)周圍組織內(nèi)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Prox-1及平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，觀察淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增生及集合淋巴管再生情況。通過檢測基因修飾后2周、4周偶氮藍(lán)皮下注射后大鼠經(jīng)處理的血液樣本在620nm下的吸光度，觀察大鼠患肢淋巴回流功能改善情況。
　　 結(jié)果：
　　 實(shí)驗(yàn)組大鼠(注射AdVEGFC)術(shù)后1周、2周、4周Prox-1的表達(dá)明顯強(qiáng)于對照組大鼠(注射AdFlag)。實(shí)驗(yàn)組及對照組大鼠直到術(shù)后4